制備熒光抗體是免疫熒光組織化學的重要技術之一，制備特異性強和高效價的熒光抗體必須選用高質量的熒光素和高效價的抗體。
一、熒光素
熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發光，停止能量供給，發光也瞬時停止。可以產生明亮熒光的染料物質，稱熒光素。目前主要常用于標記抗體的熒光素如下：
1、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）
FITC是一種呈黃色粉末狀，性質穩定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年，易溶于水和酒精。最大吸收光譜為490~495nm，最大發射光譜為520~530nm，呈現黃綠色熒光，分子量為389.4。在堿性條件下，FITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵結合，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子上最多能標記15~20個FITC分子。
2、四甲基異硫氰酸羅達明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC）
TMRITC是一種紫紅色粉末，較穩定。其最大吸收光譜為550nm，最大發射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與 FITC的黃綠色熒光對比清晰，與蛋白質結合方式同FITC。它可用于雙標記示蹤研究。
3、得克薩斯紅（texas red)
得克薩斯紅是一種褐色粉末狀，易溶于有機溶劑，性質穩定，在4℃下能保存2年以上，最大吸收光譜為 590-595nm，最大發射光譜為620-630mm，共有四種結構，常用的分子量為625.15。
4． 其它熒光素
如4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）、7-氨基甲基香豆素（AMC）呈藍色熒光，藻紅素R（phycoerythrin-R），花青（Cyanine、Cy2、Cy3、Cy5和Cy7）等。
二、熒光素標記抗體的方法
1、FITC標記抗體的方法
（1）Marsshall氏法
材料：抗體溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶(25-50ml)
、冰及冰槽（或1000ml燒杯）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml）、pH7.2的0.01mol/L
PBS葡聚糖凝膠G-25層析柱等。
方法及步驟：
①抗體的準備：取適量已知抗體濃度之溶液，加入三角燒瓶中，再加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后抗體濃度為 20mg/ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置于冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5~10min。
②熒光素的準備：根據標記的抗體總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。
③結合：邊攪拌邊將稱取的熒光素漸漸加入抗體溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約在 5~10min內加完），加完后，在4℃左右繼續攪拌12~18h，通常將裝置安放4℃冰箱或冰庫中進行。
④透析：結合完畢后，將標記的抗體溶液離心（2000r/min）10min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中再置于燒杯中用0.01M pH7.2緩沖鹽水透析（0~4 ℃）過夜。
⑤過柱：取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。