三、ICC在細胞功能研究中的應用
形態學研究目的之一是揭示組織細胞結構特征及其功能意義。利用ICC顯示給與細胞增殖標記物，是組織細胞學研究中形態和功能相結合的重要手段之一。目前常用的細胞增殖標記物有4種，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNA polymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen）,Ki—67 等，相對應的4種單克隆抗體均有商品出售。因組織細胞內無內源性Brdu存在，所以Brdu應用較廣。Brdu為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。
筆者在觀察大鼠小腸上皮細胞增殖、代謝時，一次腹腔注射Brdu（Sigma）4mg/150～200g體重，分別在給藥后1h和1、2、3、5、7天取小腸，應用抗Brdu抗體，ICC染色，可見腸上皮細胞從腸腺至絨毛頂端增生移行。在計數免疫活性細胞研究中，一次注射Brdu后，計數瞬間進入S期細胞數或連續多次注射Brdu，計數注射Brdu期間進入S期細胞的總和。另外在臨床上，術前或術中給與Brdu，判斷腦腫瘤細胞分化程度、惡性度等亦較常用。
摻入雙鏈DNA內的Brdu，以氫鏈與腺嘌呤結合，不能直接與抗Brdu抗體反應，需經解鏈使Brdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單克隆抗體與增殖細胞核內的Brdu結合，再經酶標抗小鼠IgG抗體孵育、呈色，顯示進入S期細胞的情況。
鹽酸和蛋白酶處理等可引起其它抗原或組織形態發生變化。為此，Conchoroff(1985)等制備了一種單克隆抗體（Bu—1），其培養液上清能與雙鏈DNA的Brdu反應，因為培養液上清中含有DNA酶，可分解雙鏈DNA，顯露Brdu，達到染色目的。筆者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—鹽酸處理，亦得到了良好的染色結果。簡述染色步驟如下（Matsuna,1989）：
（1）冰凍切片/石蠟切片準備同前。
（2）TBS沖洗，Baker’s液固定10min，室溫。
（3）TBS沖洗，1%戊二醛固定5～10min，室溫。
（4）雙蒸水沖洗，0.006%(冰凍切片)或0.02%(石蠟切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。
（5）雙蒸水沖洗，4N HCl 30min，室溫。
（6）PBS充分沖洗，使切片pH回至中性。
（7）封閉性阻斷劑20min，室溫。
（8）抗Brdu抗體孵育1～2h室溫或4℃過夜。
（9）PBS沖洗，HRP標記抗小鼠IgG抗體45min，室溫。
（10）PBS沖洗，DAB/H2O2呈色。
（11）輕度蘇木精復染，脫水透明，封片同前。分裂增殖細胞核呈棕褐色。
采用雙重或多重染色、觀察何種細胞分裂增殖時，首先應染色其它抗原物質，最后顯示Brdu。通常在第一種抗體呈色后，再經1%戊二醛固定5～10min，重復上述程序，均可獲得較滿意的染色結果，分裂細胞核呈棕褐色；顯示其它抗原用ALP標記抗體，則細胞漿為紅色（FR）或藍色（FB）。
四、 ICC在原位雜交技術中的應用
傳統的ICC法主要用于檢測組織細胞中含有何種物質，根據該物質的作用，推測其組織細胞生理、病理意義。但該物質來自何處，是否是陽性細胞合成往往較難判斷，結合免疫電鏡及雙重染色等方法，在某種程度上，有助于推斷該物質的來源。然而通常ICC法顯示的是組織細胞已經合成的物質（過去時），本身不能說明陽性組織細胞目前的功能狀態，亦無法預測細胞將合成何種物質，發揮什么功能，因此，單純的ICC法存在著被動性。
近年來，ICC法與原位雜交技術結合，使細胞內活性DNA可視化，直接顯示某染色體上，何種基因活性化或非活性化，描述組織細胞現在的狀態，同時亦可預知未來組織細胞將合成何種物質，發揮哪些功能等，直接觀察組織細胞的時空改變，這在病理生理研究中有著重要意義，為形態學研究開辟了令人矚目的前景。
眾所周知，機體內不同的蛋白質發揮其特定的功能，與其氨基酸序列密切相關，而它的氨基酸序列又是DNA通過mRNA轉錄控制的。因此檢測該DAN/mRNA的分布，可判斷組織細胞的功能狀態。為在組織細胞水平檢測DNA/mRNA等一定堿基序列的核酸存在與否，Gall（1969）等建立了原位雜交方法（詳見第二十章 ）。
在檢測某種特定的蛋白質在哪一類細胞內合成時，常常應用連續切片或鏡影切片，原位雜交法顯示合成該蛋白質的mRNA，ICC法染色其蛋白質抗原，二者存在于同一細胞時，具有較強的說服力。同一切片進行上述雙重染色時，原位雜交步驟中，大多數抗原物質的抗原性往往易被破壞，所以最好在ICC染色后再進行原位雜交染色。ICC染色中，抗體內含有RNase等可能破壞細胞內的mRNA，為此應選用精制IgG抗體，并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖，其化學性質與核酸類似，能夠與以核酸為底物的酶（RNase）結合，從而保護mRNA免受破壞。另外，ICC染色以DAB呈色時，核酸探針易吸附于DAB產物上，需注意。
近年隨著細胞工程的進步，ICC、原位雜交技術將在細胞生物學、組織學、遺傳學、病毒學、臨床疾病診斷等各個領域，得到更廣泛地應用。
參考文獻
1.Bigbee JW,et al . Effects of primary antiserum dilution on staining of antlgen rich tissue with the peroxidase antiperoxidase technique. j Histochem Cytochem. 1977；25：433～447
2.Borrsma DM. Preparation of HRP Iabelled antibodies。In Cuello AC(ed) lmmunohistochemistry, John Wiley&,Sons, New York ：Bris－bane Toronto Singapore, 1983：87～100
3.Conchoroff NJ, et al . A monoclonal antibody reactive with 5—Boromo—2 deoxyuridine that does not requireDNA denaturation。Cytometry,1985；6t506～512
4.Costa M, et al. Immunohistochemical localization of polypeptides in peripheral autononic nerves using whole mount preparation, Histo－chemistry, 1980；65：157～165
5.Cumming R. Cyclic nucleotide losses during tissue processing for immunohistochemistry。j HistochemCotychem, 1980j28：54～55
6.Gall JG, Paudue M. Formation and detection of RNA—DNa hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natu Acad Sci USA, 1969：63,378～383
7.Grzanna R, Light microscopic immunocytochemistry with fixed unembedded tissue, In Bullock GR&Petrusz P·(eds.)Techniques in immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：183～204
8.Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined speciflcity, Nature,1975；256：495～497
9.Imagawa M, et al. Characteristic and evaluation of antibody horseradish peroxidase conjugates prepared by using maleimide compound,glutaraldehyde and periodate. J Biochem, 1982 j 4：41～57
10.Li CY, et al. Use of azide and hydroRen peroxide as an inhibitor for endogenous peroxidase in the immunoperoxidase method , J Histochem Cytochem, 1987；35： 1457～1640
11. Matsuno K, et al. Splenic outer periarterial lymphoid sheath (PALS)：An immunoproliferative microen- vironment constituted by antigen laden marginal metallophils and ED3 positive macrophages in the rat. Cell Tissue Res, 1989；257：459～470
12.Nakane PK, Pierce GB. Enzyme labelled antibodies：Preparation and application for the localization of antigens。j Histochem Cytochem, 1966；14：929～931
13.Norrden SV, Polak JM. Immunocytochemistry today techniques and practice, In Polak JM&Norrden SV(eds.) Immunocytdchemistry. London：Wright PSG Bristol, 1983：11～42
14. Oi VT, Herzenberg LA. Imrnunoglobulin producing hybrid cell lines. In Mishell BB and Shiigi SM, (eds.) Selected methods in cellular immunology, San Francisco：Freeman WH and Company, 1980：351～375
15. Sato Y, et al . The AMeX method. A simplified technique of tissue processing and paraffin embedding with improved preservation of antigens for immunostaining. Am J Pathol, 1986；125：431～435
16.Shi SR, et al . Antigen retrieval in forrnalin fixed,paraffin embedded tissue：An enhancement method for immunohisotchemical staining based on microwave oven heating of tissue sections 。j Histochem Cytochem, 1991；39：741～748
17.Sternberger LA, et al . The unlabelled antibody enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen –antigody complex (horseradish peroxidse antihorseradish peroxidase ) and its use in the identification spirochetes, J Hsitochem Cytochem, 1970；18：315～333
18. Sternberger LA, Immunocytochemistry。New York：John Wiley&Sons, 1979
19.Sternberger LA, Conjugated antibody method. In ：Sternberger LA(ed) Immunocytochemistry。3rd edi—tion, New Yor ：John Wiley&Sons, 1986
20. Vacca LL. Double bridge technique of immunocytochemistry.In：Bullock GR&Petrusz P. (eds,) Tech. niques in Immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：155～182
21. Yasuda K, et al. Application of ultrasound for fixation：Combined use with microwave to enhance the effect of chemical fixation. Acta Histochem Cytochem, 1992；25： 237～244
22. Zhou DS, Komuro T. Interstitial cells associated with the deep muscular plexus of the guinea—pig small intestine, with special reference to the interstitial cells of Cajal. Cell Tissue Res, 1992；268： 205～216