生產企業必須能夠克服大量的技術難題才能制備出能應用于診斷領域的免疫金復合物。
免疫金標記技術是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內的許多蛋白質標記形成免疫金復合物的技術。雖然這種免疫金標記技術呈 現出多種多樣的應用方式，但目前主要應用是以快速檢測試紙盒的形 式使用于疾病的診斷和監測。1
在過去的十年里，基于膜上的快速診斷技術（包括側向層析和滲濾兩種形式）的發展為金標免疫試劑創造了巨大的市場。使用該技術 制備的標記物作為檢測系統中的指示試劑使用在檢測敏感癥、傳染病、 環境污染物、毒品、心梗標志物、早孕以及獸醫等領域。2
如同其他標記結合物一樣，獲得成功的結果必須通過采用優質的試劑（蛋白質和膠體金）、豐富的生產經驗和對標記物產品最終結果分析的完整的知識結構，這需要與免疫金產品使用 方法的終端客戶培訓一起進行。
蛋白質的標記
在體外診斷應用領域，通常采用抗原或抗體與免疫金結合制備免疫金結合物。采用單克 隆抗體或多克隆抗體，是影響抗體標記的因素之一。
雖然診斷產品中大多數抗體標記采用 IgG 抗體，但 IgM、IgE 和 IgA 抗體也可以成功標記上膠體金。標記時，進一步必須考慮抗體的亞型。在鼠抗IgG亞型中，例如 IgG1 亞型成 功率高，而 IgG3 亞型被證實有技術難度。
將抗原標記膠體金也面臨技術難題。將常見的抗原標記上膠體金比較容易。但是受抗原 與膠體金結合方式的影響，金標記覆蓋的蛋白反應決定簇小于50%時才能高成功率制備出標 記物。因此，考慮蛋白結合金的方式對標記開發人員非常重要。3
聯接機理
研究人員普遍接受的理論為，三種特異的氨基酸殘基在金顆粒與蛋白質的聯接作用中發 揮著重要的作用。而賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸這三種氨基酸與膠體金聯接的作用機理各不相同。4
?賴氨酸帶有較強的正電荷，因而自然吸附帶負電荷的金顆粒；
?色氨酸主要通過疏水相互作用與膠體金相聯接；
?半胱氨酸通過 SH-與金表面以共用電子的形式形成配位鍵。抗體通過這幾種作用力與膠體金顆粒牢固、穩定的、不易分離的結合在一起。在很大程度上，標記成功與否取決于上述三種氨基酸殘基在被標記蛋白質上的結合位點。
在某種情況下，氨基酸聯接于蛋白質的活性部位，從而干擾蛋白質的反應活性。空間位阻的限制，當這幾種氨基酸殘基定位于抗體的抗原結合部位或抗原的特異抗體結合決定簇部位時，可能出現這種類型的干擾。如果被標記的蛋白質分子未做特定的處理就幾乎不可能克服這種干擾。
為了在免疫檢測中獲得最佳的靈敏，這三種與標記相關氨基酸的正確結合是非常重要的。就標記抗體來說，這三種氨基酸應定位于 Fc 區，而對于標記抗原，它們應遠離抗原的反應決定簇位置。
標記方法的調試
為了開發、優化單一標記的膠體金結合物，研究人員通常制備小批量的多達60批次的不 同膠體金結合物。每批次膠體金結合物在某一關鍵制備步驟上都與其它不同，各批次都被測 試從而確定哪種標記技術對于最終的檢測分析可能獲得最佳的反應結果。
這類調試應該包括所有可以改善膠體金結合物的靈敏度、交叉反應以及潛在穩定性的技 術參數。典型的測試應包含但不應僅限于抗體工作緩沖液、防腐劑的類型、鹽度、表面活性 劑含量、膠體金顆粒的尺寸、封閉劑的類型、總蛋白濃度、結合物工作緩沖液以及結合物的 濃度。為了確定不同封閉劑的效果，建議考慮以下調試內容：
?封閉劑的類型（如酪蛋白、BSA、卵清蛋白、人血清白蛋白、PEG、非特異性 IgG）
?封閉劑的純度
?封閉劑的含量
?封閉劑對整個測試反應的兼容性
研發人員應該根據在原型產品上的量的調節試驗結果確定上述所有試驗指標最佳值。最后，無論如何，唯 一的檢測方式是將結合物應用于盡可能模仿最終測試條 件制做出來的小型測試條前期產品中。對于基于膜基礎 上的檢測分析來說，最簡易的方法是使用半試紙條形式 來做檢測，僅需要使用捕獲抗體和純抗原。在 使用這種簡單的測試形式下，很多小批量結合物就能被評估得到比較合適的測定結果，而可以避開一些普遍的問題例如：與干燥相關的技術問題或 者樣品緩沖液的問題。
為了滿足上述試驗的要求，常需要 3mg 抗體或者 5mg 抗原。采用小樣樣本，能夠獲得 最優化的膠體金結合物制備參數，并能提供初步的評估樣本。一旦使用優質的抗體或者抗原 用于標記，且確定了制備參數，生產商就能容易地制備重復性好和批量化的供選用的結合物。
用于膠體金標記原料的品質
應用在制備免疫金結合物的特異性抗體的穩定性主要取決于檢測試驗的技術條件。 對于側向層析分析，最好的抗體形式是采用一般的單克隆配對。在這類檢測分析中，一種單克隆抗體被標 記膠體金作為指示劑，而另一種被固定于硝酸纖維素膜 上作為捕獲劑。每種抗體對于抗原表面的不同反應決定 簇都應該是特異識別，并且這些抗原決定簇在空間結構 上距離較遠。
多克隆抗體也可以被使用，但至少是必須經過 protein-A 柱層析純化。在多數情況下，抗體經親和層析純化后能制備出具有較高靈敏度和特異性的結合物。這當然取決于符合試驗檢測可接受交叉 反應的技術要求。
親和層析純化 硫酸銨沉淀法或 DEAE 純化的血清，含有大量的雜蛋白將競爭性結合膠體金顆粒表面的 結合位點。這些雜蛋白擁有高含量的控制蛋白與膠體金結合的三種氨基酸殘基，很容易與裸 露的膠體金顆粒結合。出現這種情況時，檢測系統中指示劑的靈敏度水平降低。
同理，如果采用經A蛋白或G蛋白柱層析純化的抗體，然后IgG片段中可能含有大量的非特異性的IgG，而不是需要的特異性IgG.所有的IgG將與膠體金結合，結果可能是低靈敏度。
從親和層析柱上洗脫下的高親和抗體應該是高親和抗體，從而可以產生高特異性的膠體 金結合物。這些抗體可能需要進一步的處理以避免交叉反應。雖然親和純化法耗費大量的時 間、經費、血清，但是通過該方法可以獲取任何免疫分析必需的關鍵原料——高質量的結合物。
抗原的標記 成功制備抗原標記物依靠兩個因素：控制抗原與膠體金顆粒聯接的三種氨基酸殘基的空 間位置和抗原大小。
大多數的抗原標記物是被使用在快速檢測試紙上，例如血清的雙抗體夾心法或競爭法檢測。
在這種情況下，通常選擇 40nm 膠體金顆粒。直到最近，研究人員發現，40nm 膠體金顆粒標記的蛋白分子量下限為 30KD.然而在某些條件下，通過先進的標記技術可以將該限制 降低到一半至 15KD.使用這些小顆粒標記的主要限制是被標記蛋白必須包含足夠數量的賴氨 酸、色氨酸和半胱氨酸殘基。抗原常不含有足夠的半胱氨酸殘基，以至抗原和膠體金顆粒之 間的結合力相對較弱且容易斷裂，尤其在樣本中存在高親和力的抗體時。
對于分子量低于30KD的抗原，通常采用其他技術方法，例如標記較小的膠體金顆粒。 在檢測線處由于膠體金顆粒過小使得可見度低很可能導致靈敏度降低。
對于含有較少或者不含上述三種聯接氨基酸殘基的抗原，一種有效的解決方法是通過將抗體與載體分子預先聯接，比如BSA或KLH.然而這種技術不象說起來那么簡單，不是業余 的蛋白化學家所能做到的。必須謹慎考慮使用的聯接物類型、聯接物長度，半抗原與 BSA 的 摩爾比例和載體分子類型等因素，確保暴露抗原活性反應決定簇部位的結合物可重復制備， 且在測試中蛋白載體膠體金結合物具有最大的敏感性。
原料顆粒 膠體金顆粒大小的選擇取決于膠體金結合物的用途。如下段落描述了兩個最常用的膠體 金應用領域：顯微檢測技術和快速診斷技術。
顯微檢測技術 任何1-40nm的膠體金結合物可以應用于電子顯微鏡和光學顯微鏡檢測 領域。然而即使在透射電鏡放大25萬倍的情況下，也不可能觀測到1或2nm的膠體顆粒。利用銀增強膠體金技術可以讓終端客戶能夠看到膠體金標記的這種較小的抗原性位點。
銀增強染色技術是指通過銀鹽在膠體金顆粒表面沉積，使膠體金顆粒增大到在顯微鏡下能觀察的尺寸。當所有的膠體金顆粒都是同樣大小和形狀時，該方法具有效率高、易控制的特點且低變異系數。使用如 1-2nm 的膠體金小顆粒時，由于空間位阻較大的膠體金顆粒不能標記的一些抗原決定簇位點，也變得容易接近。因而，一旦確定抗原位置，在銀增強染色技術作用下，金標記變得容易聯接和形成。
在不采用銀增強染色電鏡技術的情況下，幾個不同的抗原反應決定簇可能被標記在相同的片段上。在這種情況下，采用可分辨出的不同尺寸大小的膠體金標記特異性抗 體，該抗體對不同反應決定簇具有特異識別。
快速診斷技術（側向層析和滲濾測試盒）。對于該應 用方向，最常用的膠體金顆粒是40nm.4
在標記IgG時，40 nm的膠體金顆粒提供最大的可視性和最小的空間位阻。分子量為160kDa 的IgG分子，長度大約為 8nm.40-100nm間的膠體金顆粒比較順利標記到IgG抗體上。比40nm大的顆粒有較大的可視性，但較大膠體金顆粒在1ml溶液時520nm吸光度較小，因此較少在檢測線處被捕獲。綜上所述，同40nm或60nm膠體金標記的抗體相比，較大顆粒的膠體金結合物對1-10ng/ml分析物具有較低的靈敏度。
60nm膠體金顆粒非推薦使用，但可以應用于快速診斷分析。其不同于40nm 膠體金顆粒，顏色偏淺。優質的40nm膠體金為櫻桃紅色，而60nm膠體金為深粉紅色。在某種情況下，樣品類型可使膜上殘留背景底色，這種輕微的顏色差異可以使信號容易識別。比如，含有膽紅素的樣本將留下的背景底色，相對褐色，粉紅色較紅色容易被識別。
如果用于標記分子的分子量小于160kDa，20nm 膠體金顆粒更適合。20nm 膠體金顆粒通常用于標記鏈霉親和素、A 蛋白和抗原，這些被標記蛋白的分子量小于60kda.
靈敏度 隨著快速診斷技術進步使膠體金結合物的靈敏度得到提高。目前，在大多數快速診斷分析中，檢測下限達到1ng/ml.如果優質抗體，可以低到10pg.然而隨著銀增強技術的發展，檢測靈敏度將進一步提高，可能提高10-100倍。4
結 論
膠體金蛋白質結合物的制備過程并非輕而易舉的。制備優質的膠體金結合物過程以及缺 乏經驗的生產商將面臨產品批次的重復性、規模擴大等技術難題。
參考文獻
1、 S Brunelle, "Electroimmunoassay Technology for Food-Borne Pathogen Detection," IVD Technology 7, no.5 (2001): 55–66.
2、 S Wallace, "Bioterrorism Tests in Demand," IVD Technology 7, no. 6 (2001): 14.