免疫鐵蛋白電鏡技術

1．基本原理

鐵蛋白的分子量460kD，為一種含鐵(約占23%)的蛋白質。直徑10―12nm。目前常用的間接免疫染色技術是應用低分子量的雙功能試劑將第二抗體與鐵蛋白相連，制備標記抗體。此復合物既保留了抗體的免疫活性，又因鐵蛋白含有2000―3000個鐵原子的致密鐵離子核心，形成四個圓形致密區，所以，具有較高的電子密度，易于電鏡觀察。

早年的研究中，因沒有鐵蛋白標記抗體商品出售，所以多數實驗室需要自己制備鐵蛋白，再標記抗體，操作較麻煩，且質量控制難度也較大，難以廣泛應用。目前已有鐵蛋白標記的多種間接抗體(第二抗體)商品出售。

2．電鏡標本的制備方法

1. 固定：與電鏡酶細胞化學相似，可用醛類和OsO₄雙重固定，以保存組織細胞的超微結構。有文獻記載，4%多聚甲醛/0.5%戊二醛(pH7.2)4℃固定，繼之0.2%OsO₄ 后固定，并不影響抗原活性，但筆者認為應盡量避免或縮短OsO₄ 后固定時間為宜。

鐵蛋白標記的抗體分子量較大，較適合于細胞表面抗原的定位研究，而對細胞內抗原的  研究則需進行適當處理，以增強其標記抗體的通透性。常用方法如下：

① 凍融法：小塊組織或細胞固定后，可用液氮速凍、室溫迅速融化，使細胞膜破裂，有利于標記抗體進入細胞內與其相應抗原結合，但超微結構的保存不甚理想。

② 冰凍切片法：固定的組織經5%蔗糖脫水，液氮速凍，制作10―15gm厚的冰凍切片，PBS漂洗，直接進行包埋前免疫染色，再按常規電鏡樣品處理。

2. 免疫染色：多用包埋前染色。以間接染色法使用居多，孵育均在濕盒內進行，一般操作程序如下：

① 將組織標本制成10～15um冰凍切片；

② 切片漂洗后，1%BSA孵育，室溫15分鐘；

③ 特異性抗體(第一抗體)中室溫孵育30～60分鐘，也可4℃孵育過夜；

④ 冷PBS充分漂洗3次，每次3～5分鐘；

⑤ 鐵蛋白標記的第二抗體孵育，室溫30～45分鐘；

⑥ 漂洗同上，再經戊二醛固定1小時；

⑦ 漂洗后，1%OsO₄ 固定15～30分鐘；

⑧ 樣品的脫水、包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等處理與常規電鏡相同。

冰涼超薄切片鐵蛋白標記抗體免疫電鏡圖