免疫復合物方法檢測酪氨酸蛋白激酶

基 本 方案 酪 氨酸 蛋白 激酶 的免 疫 沉淀 和自 身 磷 酸化 檢 測

以下步驟可以釆用淋巴或非淋巴細胞、原代細胞或培養的細胞系、活化或非活化的細胞。

材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)

待檢測的細胞 冰預冷的 PBS

含蛋白酶抑制劑的 I X 細 胞 裂 解 液（新鮮配置并于冰上保存）

含蛋白酶抑制劑的 5 X 裂 解 液（細胞活化用，新鮮配制并于冰上保存）

考馬斯蛋白檢測試劑（Pierce) 或類似試劑

多克隆或單克隆的兔抗 src-相 關 T P K 抗 血 清（U B I 、 Oncogene Science 或 Santa
Cruz Biotechnology)

對 照 血 清（Sigma) : 正 常 的 兔 血 清（如使用多克隆抗血清），或 同 型 IgG (如使用
單克隆抗血清）

Pansorbin ( 1 0 % 福 爾 馬 林 固 定 的 金 色 葡 萄 球 菌 ； Calbiochem) ， 或 蛋 白 A /蛋白
G-Sepharose (Pharmacia Biotech)

親和純化的兔抗鼠 IgG (如使用單克隆抗體； Organ o n T e k n i k a C a p p e l)

冰預冷的 N P -40 緩沖液

冰預冷的酪氨酸蛋白激酶（T P K ) 緩沖液

l 〇/mi 〇 l/L A T P 溶液，新鮮配制

5m C i / m l [y-32P ] A T P (3000Ci/m m o l ; D u P o n t N E N ) : 在準備反應混合物前
一小時將其在冰上融化

冰預冷的改良 R I P A 緩沖液

I X S D S /上樣緩沖液

細 胞 刮 具（用于貼壁細胞）

Labquake 搖 床（PGCScientific)

l 〇〇°C 加熱塊

W h a t m a n 3M M 濾紙

注 ：除洗滌外，所有的步驟均在冰上或 4°C 冷室進行。
收 集 無 需 活 化 的 細 胞 。

la. 對于懸浮細胞，需室溫， 500 g 離 心 I O m i n 收集 ，棄上清，以冰預冷的 P B S 重懸細
胞 。如前所述離心和棄上清。對于貼壁細胞，當 細 胞 貼 壁 時 以 5?I O m l 冰預冷的
P B S 洗一次，旋動并吸棄 P B S 。于 IO7?IO8 個 細 胞 加 2?3m l 冰 P B S ，以細胞刮具
收集細胞。如前所述懸浮細胞的條件離心。如有必要，于一 70°C 保存細胞沉淀，細
胞裂解物不能冰凍（步 驟 5)。

2a. 加 入 I m l 冰預冷的含蛋白酶抑制劑的 I X 細胞裂解液并渦旋混勻，冰上靜置 lOmin。
收 集 不 同 時 間 進 程 的 活 化 細 胞 。

備 選 方 案 1 蛋白激酶對外源底物的磷酸化檢測

附 加 材 料

備 選 方 案 2 蛋白激酶對外源底物的磷酸化檢測

附加材料