全新測序技術利弊比較之單分子測序

　　在去年召開的美國微生物學會上，來自明斯特大學的醫學微生物學家Dag Harmsen開始聽到了有關德國大腸桿菌疫情爆發的傳言，這場疫情首先在德國北部地區爆發，感染了至少4000人，奪去了超過50人的生命(德國范圍內)，在德國以外的歐洲地區也發現了76名患者。

　　Harmsen教授在這場疫情中發揮了重要的作用——他們通過將引發此次疫情的O104：H4型腸出血性大腸桿菌與2001年采集自一名溶血性尿毒癥(HUS)體內的O104：H4型腸出血性大腸桿菌進行基因對比后，發現，兩種菌株并非同源，引起此次德國EHEC暴發的O104:H4菌株來自一種腸聚集性大腸桿菌EAEC O104:H4 55989菌株的變異，其中還摻雜了一種目前未知的由志賀毒素產生的O104：H4菌株。

　　在這一場“戰役”中，Harmsen教授主要采用的就是新一代測序技術，他說，“至今，新一代測序技術已經遍布全球上百個基因組測序中心”。并且隨著更多更新技術的發展，未來新一代測序技術將發展出下下一代創新技術，為基礎科學與臨床治療提供越來越完善的幫助。近期The Scientist雜志就以“Sons of Next Gen”為題，介紹了目前值得關注的各種新技術。

　　單分子測序

　　Pacific Biosciences公司在2011年4月向市場推出了他們的一款全新產品：the Single Molecule Real Time (SMRT) 測序儀，這一款儀器與傳統測序儀一樣，也是依賴于熒光標記核苷酸，但是有一點卻不同——SMRT一次只聚焦于一個分子，消減了耗時的擴增步驟。

　　Pacific Biosciences首席科學家Eric Schadt解釋道，這一系統能在15萬個小孔(小孔直徑為幾十納米，蝕刻于一種鋁薄膜上)中捕獲單個DNA分子，以及一個DNA聚合酶，然后將四種熒光基團標記的核苷酸加在上面。當DNA聚合酶將核苷酸加到序列上的時候，利用兩種不同波長的激光束掃描每個小孔，與增長DNA鏈匹配的核苷酸就發出熒光，這時精密的成像儀器就能從光激發顏色中識別出加入DNA鏈的特殊核苷酸。“這樣你就能確實觀察到DNA的一個單分子”，Schadt說。

　　SMRT無需仔細調整多個DNA片段序列——由于錯誤積累，逐漸導致非同步，就可以閱讀非常長的片段，平均可超過3000個堿基對，甚至達到上萬個堿基對。而傳統的測序方法只能達到35-400個堿基對的讀長。

　　這種測序能力對于來自加州大學戴維斯分校的遺傳學家：西蒙·陳(Simon Chan)來說意義重大，他希望能搞清楚端粒中重復的，迅速進化的DNA是否參與了形態變化。在此前一項研究中，陳博士分析了不同類型序列模式，追蹤了新重復重組出現的時間，但是由于每個序列都很相似，因此很難見短DNA片段，精確組裝成正確序列，陳博士說，“現在我們采用了長讀長測序，更全面的了解了這些序列，解決了問題。”

　　但是SMRT的價格并不親民，比較高，這就意味著只有少數幾個大型測序中心能買得起。而且這種儀器的錯誤率也相對比較高，來自Warp Drive Bio的Keith Robison說，“一個run大約會出現15%”，他分析過幾種測序儀的數據。不過由于出錯是隨機出現的，而SMRT讀長很長，因此可以將DNA片段前后相連，多做幾次獲得比較精確的結果，他表示。

　　Robison認為這種儀器最有利的應用是在單體型分析方面，因為這種研究需要很長讀長，或者從頭測序，而且發生小錯誤也無關緊要。