亞甲藍因為有還原性，其注射液被用來治療正鐵血紅蛋白血癥。也用于搶救硝基苯、亞硝酸鹽和氰化物中毒等。對于一氧化碳輕微中毒者可靜脈注射亞甲基藍進行解毒。臨床用于治療磺胺過敏癥。 [1]
因為其殺菌消毒的作用，口服亞甲藍或用其溶液沖洗可以治療膀胱炎和尿道炎。另外，亞甲藍在進入人體30分鐘（注射）至幾小時（口服）內會從尿中排出，導致尿液暫時呈藍色，因此也用來作腎功能測定。
觀賞魚養殖中，0.1-0.2ppm的亞甲藍溶液也被用作消毒，或治療白點病等疾病。
