microRNA-RISC對靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，有三種方式。
第一種是切斷靶基因的mRNA分子——miRNA與靶基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以這種方式，靶基因mRNA斷裂后，無poly(A)的分子的3‘ 端加上多個U并很快降解，含poly(A)的分子能穩定存在一段時間（如擬南芥miR-171）。在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉錄因子），盡管還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標靶，這仍是第一次發現miRNA 和其潛在的目標靶完全互補，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。
第二種是抑制靶基因的翻譯——作用時與靶基因不完全互補結合，進而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩定性，這種miRNA是目前發現最多的種類（如線蟲lin-4）。而在植物中極少數的miRNA通過此方式來抑制靶基因。
第三種是結合抑制——具有以上兩種作用模式：當與靶基因互補結合時，直接靶向切割mRNA；當與靶基因不完全結合時，起調節基因表達的作用。
