催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應。反應式為32P32Pi dNPPP←dNP32P32P PPi→DNA
最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應叫缺口平移(Nicktranslation)。當雙鏈DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產生切口時，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的NDA鏈，同時切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新摻入的脫氧核苷酸三磷酸為α-32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標記的DNA分子，可以用作探針進行分子雜交實驗。
盡管DNApolⅠ是第一個被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復制的主要聚合酶。主要證據如下:[1]純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內DNA合成速率要比此高二倍數量級；大腸桿菌的一個突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復制不正常；而在另一些突變株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA復制卻正常，而且此突變株增加了對紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復制關系不大，而在DNA修復中起著重要的作用。
一些特定的DNA聚合酶對于化學修飾性核苷分子顯示出驚人的耐受性，從而為高度功能化的核酸分子的有效合成提供了令人激動的新機遇。