環孢菌素A發揮作用的主要機制是環孢菌素A與親環孢素形成復合物再與依賴鈣/鈣結合蛋白的鈣調磷酸酶作用，抑制NF-AT的去磷酸化使其不能進入核內，從而抑制IL-2的產生，T淋巴細胞的生成受抑制。
環孢菌素A結構的1、2、3、10、11位氨基酸是環孢素A與CyP的結合區，3-9位氨基酸是與CaN作用的效應區。CyP是廣泛存在于原核和真核生物組織中的一種蛋白，是肽酰-脯氨酰順反異構酶家族成員，具有PPIase活性，可以催化肽或蛋白底物的肽酰-脯氨酰順反式之間的內部轉化。
當CsA和CyP結合后，CsA分子結構與游離CsA分子結構相比其構象發生了明顯的變化，分子中原有的氫鍵均斷裂，形成新的氫鍵。分子中的酰氨鍵也由順式轉化為反式，這樣形成的復合物才能與CaN作用；單獨的CsA或CyP都不能與CaN作用。研究發現，環孢菌素A只需要結合1%～10%的親環孢素就能發揮其免疫抑制活性。但是在環孢菌素中與CyP的結合能力的強弱并不能體現為免疫抑制的強弱，與CyP結合能力強的免疫抑制活性不一定就強，而與CyP結合能力很弱的也不一定就沒免疫抑制活性。
CsA和CyP的結合是產生抑制CaN活性的基礎，在環孢菌素A與CyP的結合區中對結合有重要貢獻的是CsA的1位氨基酸，氨基酸MeBmt結構與CyP的最適底物結構相似，形成的過渡態能量最低最穩定，這對CsA和CyP的高親和力是很重要的。