細胞經誘導或抑制后,需對自噬過程進行觀察和檢測,常用的策略和技術有:
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構,普通光鏡下看不到,因此,直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀,雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1)的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構,內含胞漿成分,如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2)的特征為:單層膜,胞漿成分已降解。(autophagic vacuole,AV)
2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時長,不利于監測(Monitoring)自噬形成,人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。無自噬時,GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中;自噬形成時,GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,一個斑點相當于一個自噬體,可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成
自噬形成時,胞漿型LC3(即LC3-I)會酶解掉一小段多肽,轉變為(自噬體)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
(注意:LC3抗體對LC3-II有更高的親和力,會造成假陽性。方法2和3需結合使用,同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、檢測長壽蛋白的批量降解:非特異
5、MDC(Monodansylcadaverine,單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體,所有酸性液泡都被染色,故屬于非特異性的。
6、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色,但其能染所有的液泡,故也屬于非特異性的。