天然腸激酶由1條結構亞基 (重鏈) 和1條催化弧基 (輕鏈) 構成, 兩者通過1個分子間二硫鍵結合, 結構亞基負責將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導它向腸腔移動, 催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下, 將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶, 從而啟動各種酶原活化的級聯。
重組腸激酶 (recombinant Enterokinase, rEK) 的分子質量通常為26.3ku, 具有3個糖基化位點, 其糖基化分子質量大約為43ku。Vozza等發現, rEK體外實驗證明有全酶酶切特異性并且相較于天然腸激酶表現出對基因工程融合蛋白底物的酶切活性增強, 因而現多采用基因工程的方法生產腸激酶。近年來所做的嘗試多是克隆與表達235個氨基酸的輕鏈 (recombinant Enterokinase light chain, rEKL) 。 Janska等研究氨基末端殘基發現了EK輕鏈的三維結構與類胰蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶的結構同源性。Seong等則發現將輕鏈氨基末端的Ile突變為Val其酶活JL乎不發生改變。另外, 有研究發現EK的重鏈強烈影響腸激酶對大分子底物的識別而對合成的融合蛋白或小分子底物的識別沒有影響。