Pauling等人對一些簡單的肽及氨基酸的酰胺等進行了X線衍射分析，從一個肽鍵的周圍來看，得知：
（1）肽鍵平面—肽鍵中的C-N鍵長0.132nm，比相鄰的N-C單鍵（0.147nm）短，而較一般C=N雙鍵（0.128nm）長，可見，肽鍵中-C-N-鍵的性質介于單、雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質，因而不能旋轉，這就將固定在一個平面之內。
（2）肽鍵平面—肽鍵的C及N周圍三個鍵角之和均為360°，說明都處于一個平面上，也就是說六個原子基本上同處于一個平面，這就是肽鍵平面。肽鏈中能夠旋轉的只有α碳原子所形成的單鍵，此單鍵的旋轉決定兩個肽鍵平面的位置關系，于是肽鍵平面成為肽鏈盤曲折疊的基本單位。
（3）肽鍵平面—肽鍵中的C-N既具有雙鍵性質，就會有順反不同的立體異構，已證實處于反位。