腦膿腫的病原體多為化膿性細菌，如葡萄球菌（金黃色或白色葡萄球菌）、鏈球菌（溶血性、草綠色和厭氧鏈球菌、肺炎鏈球菌）、變形桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等。偶有樊尚氏桿菌、傷寒桿菌和副大腸桿菌類革蘭氏染色陰性桿菌所致者。約1/4為混合細菌感染。感染源不同,致病菌亦不同。如耳源性腦膿腫為變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或其他革蘭氏染色陰性桿菌單獨或混合感染。且病原體往往與耳部感染細菌一致。鼻源性腦膿腫的病原體以肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌多見。胸源性腦膿腫的致病菌多為肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌，多有厭氧菌混合感染。心源性腦膿腫的致病菌以甲型或乙型溶血性鏈球菌為多。腹、盆腔感染所致的以大腸桿菌為多。外傷感染性腦膿腫多為金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌混合感染。大多數腦膿腫的膿液培養陰性，這與運用了抗生素或未做厭氧菌培養有關，故應強調做厭氧培養。而且膿液抽出后應立即接種到培養基，才能培養出細菌，膿液還應做藥敏試驗,以便指導用藥。從抽出的膿液也可估計細菌類別,如金黃色葡萄球菌所致的腦膿腫，膿液黃色粘稠，鏈球菌所致的膿液黃白色稀薄，綠膿桿菌所致的膿液發綠有腥臭味，大腸桿菌所致的膿液有糞便惡臭。弓形蟲、阿米巴、隱球菌、諾卡氏菌等所致的腦膿腫較少見。