該酶需要四種核糖核苷酸三磷酸（NTP：ATP、GTP、CTP、UTP）作為RNA聚合酶的底物，DNA為模板，二價金屬離子Mg2+、Mn2+是該酶的必需輔因子。其催化的反應表示為：（NMP）n+NTP→（NMP）n+1+PPi。RNA鏈的合成方向也是5’→3'，第一個核苷酸帶有3個磷酸基。其后每加入一個核苷酸脫去一個焦磷酸，形成磷酸二酯鍵，焦磷酸迅速水解的能量驅動聚合反應。與DNA聚合酶不同，RNA聚合酶無須引物，它能直接在模板上合成RNA鏈；RNA聚合酶能夠局部解開DNA的兩條鏈，所以轉錄時無須將DNA雙鏈完全解開，RNA聚合酶無校對功能。