生物合成：在生物體內，DNA分子上的tRNA基因經過轉錄生成tRNA前體，然后被加工成成熟的tRNA：
tRNA前體的加工包括：切除前體分子中兩端或內部的多余核苷酸；形成tRNA成熟分子所具有的修飾核苷酸；如果前體分子3′端缺乏CCA順序，則需補加上CCA末端。加工過程都是在酶催化下進行的。
人工合成：1981年，中國科學家王德寶等用化學和酶促合成相結合的方法首次全合成了酵母丙氨酸tRNA。它由76個核苷酸組成，其中包括天然分子中的全部修飾成分，產物具與天然分子相似的生物活性（見核糖核酸和核酸人工合成）。
