與酶蛋白結合疏松，用透析法容易與蛋白部分分開的有機小分子。
由于輔酶在酶催化反應中其化學組分發生了變化，因此可以認為輔酶是一種特殊的底物或者稱為“第二底物”。這種所謂的第二底物可以被許多酶所利用。例如，已知有約七百種酶可以利用輔酶NADH進行催化。
在細胞內，反應后的輔酶可以被再生，以維持其胞內濃度在一個穩定的水平上。例如，NADPH可以通過磷酸戊糖途徑和甲硫氨酸腺苷基轉移酶作用下的S-腺苷基蛋氨酸來再生。由于輔酶的再生對于維持酶反應體系的穩定是必要的，因此，輔酶再生系統獲得了大量的實驗室以及工業應用。（輔酶不可以被叫做催化劑）