關于PCR，你知道多少？（四）TaqDNA聚合酶

在PCR反應中，毫無疑問的DNA聚合酶是最關鍵的因素。PCR最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶 I的Klenow片段。但該酶存在很多缺陷，使之不能廣為應用，比如：熱穩定性差，每次DNA熱變性后大部分酶都被滅活，需要重新加入，每個循環都要重新加入；Klenow酶反應溫度較低，引物和模板容易形成非特異性配對，產生非特異性擴增。后來人們曾使用過T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，兩者雖使擴增特異性增加，且使DNA合成速度提高了，但是由于其對熱的穩定性差而未能廣泛應用。直到耐熱的DNA聚合酶發現，才使得PCR技術得到迅速的發展和廣泛的應用。

Taq DNA 聚合酶是從一種嗜熱水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分離提純得到的。是1969見從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離得到的，它生長在70～75℃極富礦物質的環境中。

Taq DNA 聚合酶基因全長為2496堿基，編碼832個氨基酸，酶蛋白分子量為94KD。該酶在70～75℃時具有zui高的生物活性。75～80℃條件下每一個酶蛋白分子每秒可延伸約150個堿基。70℃時，酶分子延伸速率每秒在60個堿基以上。溫度降低時，延伸速率明顯下降。55℃時為每秒22個堿基，37℃時約每秒1.5個堿基，22℃時約每秒0.25個堿基。當溫度超過80℃時，合成速度也明顯下降，這可能和引物或引物-模板復合物的穩定性遭到破壞有關。

Taq DNA 聚合酶具有良好的熱穩定性。曾有測試：在92.5℃、95℃、97.5℃下，Taq DNA 聚合酶的生物半衰期分別為130分鐘、40分鐘和5～6分鐘。與大腸桿菌DNA聚合酶I相比較，Taq DNA 聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。因此，在PCR反應中如果發生某些氨基酸的錯配，這種酶是沒有修正功能的。使用Taq DNA聚合酶的PCR反應出現堿基錯配的幾率為2.1×10^-4左右。

和其他許多聚合酶一樣，Taq DNA聚合酶是Mg²⁺依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感。以鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8 mmol/L時，用不同濃度Mg²⁺進行PCR反應10min，測定結果為MgCl2濃度在2.0 mmol/L時該酶催化活性zui高，此濃度能zui大限度地激活Taq DNA聚合酶的活性，Mg²⁺過高就抑制酶活性，當MgCl₂濃度在10 mmol/L時可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能與dNTP結合而影響PCR反應液中游離的Mg²⁺濃度，因而MgCl₂的濃度在不同的反應體系中應適當調整。一般反應中Mg2+濃度至少應比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。另外適當濃度的KCl能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時明顯抑制該酶的活性。

Taq DNA聚合酶是第一個被發現的熱穩定DNA聚合酶，分子量65kD，最初由Saiki等從溫泉中分離的一株水生噬熱桿菌（thermus aquaticus）中提取獲得。此酶能耐高溫，在70℃反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列測定并可利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對DNA的特定片段進行體外擴增。在PCR過程中，由于Taq DNA聚合酶在變性步驟中（約94℃）不失活，可直接進入第二輪循環，因此不必每輪循環時重新加入新酶，這使得Taq DNA聚合酶成為PCR反應中的獨特用酶。

中文名：TaqDNA聚合酶；外文名：Thermusaquaticus；酶基因全長：2496個堿基；氨基酸：832個；屬性：熱穩定DNA聚合酶；發現者：Saiki

熱穩定性：

相對分子質量為94的Taq DNA聚合酶的活性較高，大約為200000 U/mg，在合成DNA時有一個較高的最適溫度75～80℃。Taq DNA聚合酶雖然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高溫時仍比較穩定。有實驗證明，在92.5℃、95℃和97.5℃時，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經130 min、40 min和5～6 min后，仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長。所以，在一個PCR預備試驗中，每次循環時上限溫度為95℃處理20S，則循環50次后Taq DNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實驗的需要。

Taq DNA聚合酶具有很高的加工合成特性，在最適反應溫度時，dNTP的摻入速度為35～100 nt/（s．酶分子），最長擴增長度可達7.6 kb。在低溫條件下，Taq DNA聚合酶的活性明顯降低，導致此酶在模板內局部二級結構區域的延伸能力受阻或前進速率常數與解離常數的比值發生改變。在較高的溫度（95℃以上）時，很少有DNA合成；在體外，DNA在較高溫度時的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈雙鏈結構穩定性的限制。

由于Taq DNA聚合酶的最適反應溫度高達75～80℃，故退火溫度和延伸溫度均可適當提高，這限制了非特異性擴增產物的出現，增加了PCR反應的特異性。

功能：

Taq DNA聚合酶的氨基酸順序，特別是氨基酸的前1/3區域，與大腸桿菌聚合酶I非常相似，因而它們屬于一種多功能酶。

1．具有5'→3'聚合作用

可以以DNA為模板，以結合在特定DNA模板上的引物為出發點，將四種脫氧核苷酸以Watson—Crick配對的方式按5'→3'方向沿模板順序合成新的DNA鏈。

2．具有5’→3'核酸外切酶活性

Taq DNA聚合酶具有依賴于DNA合成作用的鏈置換的5’→3’核酸外切酶活性，無論單鏈DNA還是退火到M13模板上，5’端32P標記的寡核苷酸均不降解。另外，如果模板上有一段退火的3’磷酸化的阻斷物會被逐個切換而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，即它并不抑制在3'一OH末端上游引物的摻入。

影響因素：

（一）溫度：雖然Taq DNA良合酶有很強的溫度適應范圍，但高于60℃的環境仍會使部分酶變性失活。反之，如果溫度低于正常值，酶活性受到限制。而且由于引物在低溫下（特別是25—27℃）可能與基因組中別的部分同源釣序列結合，使得一些擴增產物并非為目的序列。適當提高溫度，錯配堿基多會解離，反應產物特異性增加。Taq DNA聚合酶的最適應溫度以70℃為宜；

（二）鎂離子濃度：TaqDNA聚合酶活性對Mg2+的濃度非常敏感。TaqDNA聚合酶和許多其他聚合酶一樣，是Mg2+依賴性酶。用鮭魚精DNA作模板，dNTP的總濃度為0.9~0.8mmol/L，用含不同濃潑MgCl2的PCR系統使反應進行10分鐘。測定結果表明：在MgCl2為2.0mmol/L條件下，酶活性顯示盈高。Mg2+濃度偏高，酶活性會受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制約50%。由于Mg2+可以與負離子或負離子團（如磷酸根）結合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是磷酸根的主要來源，其中dNTP占有很大比例。因此反應系統中，Mg2+的最適濃度還要受到dNTP濃度的影響，欲獲得最佳反應結果，要對反應條件進行必要的探索。每當一個新的目的片段和引物第一次使用時，或者某種參數（dNTP或引物濃度）改變時，應進行Mg2+的最適濃度滴定。一個普遍的原則是，樣品中Mg2+的最終濃度至少要比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L。

（三）KCl的最適濃度：一般是50mmol/L，高于75mmol/L時，聚鏈反應就受到明顯的限制。當KCl濃度高達200mmol/L以上時，聚鏈反應就受到明顯的限制，此時反應進行10分鐘仍無核苷摻入．濃度均為50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl對TaqDNA聚合酶活性影響則分別為中等抑制、無影響以及25~30%促進。

（四）dNTP的濃度：均衡的低濃度dNTP更有利于酶活性的發揮，并能減少錯配，獲得多量的特異性強的DNA反應產物。各種核苷酸濃度為40umol/L的100ulPCR系統可以得到2.6ugDNA產物，而只消耗所提供核苷酸的半量；

（五）幾種變性劑對酶活性的影響：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亞砜（DMSO），二甲替甲酰胺（DMF）。甲酰胺在低濃度時對酶活性無影響，隨著它們濃度的提高，酶活性明顯下降。l0%DMSO會使酶活性減半。然而另有研究者觀察到，在某些聚鏈反應系統中，10%DMSO起著有利作用。這種結構各異的現象還表現在用尿素進行的實驗中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有報告認為0.5mol/L尿素則完全抑制PCR。總之，變性劑對TaqDNA聚合酶以及PCR系統的影響參數有待更多的實驗數據。TaqDNA聚合酶對SDS十分敏感，而某些非離子型去污劑又能完全消除低濃度SDS對酶活性的抑制效應。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵銷0.01%SDS對酶活性的影響。