農桿菌介導的植物遺傳轉化

實驗概要

以煙草葉片為材料，與對數生長期的帶有外源基因的農桿菌共培養，遺傳轉化煙草葉片，篩選抗性再生植株。掌握共培養過程關鍵技術環節及轉基因植株的篩選。

主要試劑

70%乙醇

0.1% HgCl₂

無菌水

卡那霉素(kan)

羧芐青霉素(Cb)

培養基：LB培養基100ml；MS 鹽溶液(pH 7.0)100ml，分裝到50ml三角瓶中，25ml/ 瓶；MS基本培養基  500ml(固體)；分化培養基 MS NAA 0.2 mg/l  6-BA 3 mg/l，500ml  (固體)，分裝在250ml三角瓶中，每瓶100ml；高壓滅菌

抗生素母液：Kan 100mg/ml 5ml；Cb 500mg/ml 5ml 抽濾滅菌，分裝在Ep 管中，每管1ml，-20℃保存。

主要設備

超凈工作臺

搖床

恒溫培養室

高壓滅菌器

冰箱

培養瓶

培養皿

500 ml三角瓶

50 ml與500 ml燒杯

酒精燈

槍形鑷子

手術刀

實驗材料

帶有外源基因的農桿菌

煙草無菌苗葉片

實驗步驟

1. 取普通煙草無菌苗葉片，用鋒利手術刀片切去邊緣和主葉脈，葉片切成0.5 cm見方的小塊(使四周均有傷口)，備用。

2. 取培養過夜的農桿菌LBA4404(含有卡那霉素抗性基因，Gus基因)菌液，4,000 rpm，室溫離心10 min，用MS鹽溶液(pH 7.0)重新懸浮菌體，使用時用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍。

3. 將準備好的葉圓片在菌液中感染10 min后，將葉片取出，用無菌濾紙吸去植物材料表面菌液，轉移到鋪有一層無菌濾紙的MS培養基上，28℃暗培養，共培養3-7天。

4. 共培養后將材料轉移到含有抗生素的分化培養基(篩選培養基) ( MS NAA 0.2 mg/l   6-BA 3 mg/l  Kan 100 μg/ml  Cb 500 μg/ml)培養，每15天繼代一次。

5. 待抗性芽長到2-3 cm時切下，轉至1/2 MS固體培養基上，生根培養基 (1/2MS Kan 100 μg/ml  Cb 500 μg/ml)誘導生根。

6. 利用生物化學和分子生物學方法檢測這些轉基因植株。

每組用農桿菌介導法接種煙草葉片1平皿。