說起冷凍電鏡，小編想不管是研究生還是教授大咖，可能和科研有那么一丁點聯系的人對這個名字都不會陌生，因為它實在太出名了！基于冷凍電鏡產出的科研成果很多都發表在Nature、Science、Cell等頂刊上（羨慕臉），堪稱NSC神器。冷凍電鏡技術的發展直接帶動了生命科學領域，特別是結構生物學的飛速發展，今年更是不負眾望（欺負我大化學）一舉拿下了“炸藥”化學獎！不過，這些都不重要，畢竟他是隔壁生物家的孩子，以路人甲的姿態（羨慕但是我不表現出來）看看就好，反正也用不上！沒想到一個晴朗的日子，還有些風和日麗的，Stanford的崔大神（崔屹）硬生生把它拽進了我大材料圈，而且一鳴驚人，搞了篇Science！（就問你服不服）聽到這個消息，小編不禁陷入了深深的沉思，都是做材料的，怎么差別就這么大呢？（隔壁桌小林：人家是大牛！年輕的大牛！你，呵呵~）然而，短暫的沉思之后，小編知恥而后勇，決定好好看看這個“亂入”我材料圈的隔壁生物家的孩子，萬一大老板某天心血來潮也弄了一臺放實驗室了（大老板：我就呵呵不說話），那小編豈不是有大大的優勢，機智如我！獨機智不如眾機智，所以下面，小編帶大家共同了解一下這把生物圈的屠龍寶刀——冷凍電鏡！
1. 什么是冷凍電鏡？
冷凍電鏡，全稱冷凍電子顯微鏡技術（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）（我大材料的小伙伴也快好好記住這個單詞，相信不就的將來就會成為檢索材料學文獻的熱門關鍵詞），是指將生物大分子快速冷凍后，在低溫環境下利用透射電子顯微鏡對樣品進行成像，再經圖像處理和重構計算獲得樣品三維結構的方法[1]。圖1就是中科院生物物理研究所的FEI Titan Krios 300kV冷凍電鏡，據說單臺應該在600萬美元以上。經過30多年的發展，冷凍電鏡甚至超越了X射線晶體學、核磁共振（NMR）支撐起了高分辨率結構生物學研究的基礎。
那么為什么需要冷凍電鏡技術？眾所周知，X射線晶體學是解析結構的經典方法，然而它需要獲得生物樣品單晶，生物大分子的晶體生長卻十分困難；而與此同時，材料學研究中早已使用電鏡直接觀察到了原子像[2]（作為一名材料汪，TEM、SEM的重要性我想無需贅言），于是生物學家也想用電鏡給生物大分子拍一張高清照片，解析其結構，以理解其生化反應機制，然而事情沒有那么簡單，電子顯微鏡在生物領域的應用受到了嚴重限制：（1）生物樣品含有豐富的水，而透射電鏡的工作條件是高度真空的；（2）高能電子束會嚴重破壞生物樣品；（3）生物樣品主要是C、O、N、H等輕元素，對電子的反射和散射與背景相似，獲得圖像襯度很低；（4）蛋白質分子會漂移，導致圖像模糊。經過眾多科學家的長期努力，不斷克服種種困難，冷凍電鏡技術終于發展了起來，實現了溶液里生物分子高分辨率的結構解析，使得生物化學進入了一個新時代，其中3位有開創性貢獻的科學家因此榮膺2017年諾貝爾化學獎。他們分別是：瑞士洛桑大學Jacques Dubochet教授、美國哥倫比亞大學Joachim Frank教授和英國劍橋大學Richard Henderson教授。冷凍電鏡技術給出的生物大分子高清照相的方案是[1]：樣品冷凍→低劑量電子冷凍成像→三維重構。
（1）樣品冷凍
樣品冷凍其實是科學家們很早就想到的思路，但是冷凍之后樣品中水分子形成冰晶，不僅產生強烈電子衍射掩蓋樣品信號，還會改變樣品結構。直到1974年，Kenneth A. Taylor和Robert M. Glaeser在-120℃觀察含水生物樣品時未發現冰晶形成，而且發現冷凍樣品能夠耐受更大劑量和更長時間的電子輻照，才為樣品冷凍帶來轉機。而上面提到的Jacques Dubochet老爺子則更進一步，發現了水的玻璃態，成功解決了冷凍電鏡制樣問題，如圖3 （a）所示[1]。
（2）低劑量電子冷凍成像
材料汪都知道一般做TEM、SEM的時候，樣品導電性越好，電子劑量越高，成像質量越好。然而，高劑量電子對生物大分子卻是毀滅性的，因此Richard Henderson教授提出在低溫下用盡量低的電子劑量成像。他與其合作者先后在1975年和1990年重構出了粗糙的（7?）和高分辨率（3.5?）的細菌視紫紅質蛋白的模型，如圖4所示，證明了冷凍電鏡用于生物大分子高分辨率結構解析的可行性。然而，這個歷時15年的進步與早在1984年就獲得膜蛋白3.0 ?分辨率原子模型的Hartmut Michel等人（1988年諾貝爾化學獎獲得者）相比似乎仍顯遜色。盡管情況不容樂觀，但是Henderson教授仍不斷從理論上指導冷凍電鏡技術的發展并預言：隨著電鏡技術和制樣水平的發展，冷凍電鏡必將成為疑難樣品和非結晶生物大分子結構解析的有力工具。
（3）三維重構
做過TEM的小伙伴都知道，透射電鏡得到的是二維投影圖像，要得到三維的結構，就要通過一系列建模、變換，這個過程就是三維重構。上面提到的第3位諾獎得主Joachim Frank就是和他的合作者建立了非對稱顆粒從二維投影到三維結構的方法（隨機圓錐傾斜法），奠定了冷凍電鏡單顆粒三維重構的基本原理，如圖3（b）所示[3, 4]。隨后，開發了SPIDER程序用于冷凍電鏡結構分析，得到了廣泛應用。目前，冷凍電鏡領域廣泛應用的三維重構軟件是上面劍橋大學Richard Henderson老爺子實驗室的Sjors Scheres博士（據說當時Sjors Scheres博士沒有一篇NSC論文，但Richard Henderson教授仍獨具慧眼將其引進到劍橋MRC分子生物學實驗室）開發的RELLION。
然而，即便打通了任督二脈（上述3個關鍵流程），冷凍電鏡并沒有立即獲得今天這樣的爆紅。這主要是因為（1）冷凍電鏡的信噪比低，（2）圖像攝取時漂移，使得可以獲取的二維投影仍是模糊狀態，因此僅能應用于有限的生物大分子單顆粒的結構解析，嚴重限制了其應用。直到2013年，加州大學舊金山分校（UCSF）的程亦凡教授等將直接電子探測器（DDD）用于記錄冷凍電鏡的單顆粒圖像，大大提高了信噪比與分辨率，實現了近原子分辨率（3.3 ?）的膜蛋白結構的解析，才引起了業界的轟動。隨后，冷凍電鏡技術在生物大分子3D結構解析中無往不利，堪稱屠龍寶刀。目前，美國NIH的Subramaniam實驗室成功解析了谷氨酸脫氫酶的結構，分辨率達到了1.8 ?，創造了最高分辨率的世界紀錄。