凋亡聚焦：選擇合適的TUNEL分析

　　DNA 片段化是凋亡的一個重要特點。提起DNA片段化的檢測，大家自然會聯想到TUNEL。TUNEL的全稱為Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)介導的缺口末端標記法。1992年，三名以色列科學家在JCB雜志上首次提出了片段化DNA的原位檢測方法，但這種方法飽受爭議，因為它無法區分凋亡細胞和壞死細胞。幾年后，方法經過改進，演化成現在的TUNEL分析。也就是說，TUNEL分析已經有整整20年的歷史了。

　　TUNEL技術的原理是染色體DNA斷裂時產生大量的粘性3"-OH末端，而生物素或熒光素標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下摻入到DNA的3"-末端，并通過一定的顯色系統使之顯示出來。這種方法較電泳法來說更為靈敏，熒光顯微鏡能檢測到單個細胞，流式細胞儀也能檢測約100個細胞。市場上的TUNEL分析有很多種，究竟如何選擇，且聽本文分解。

　　考慮您的樣品類型

　　您首先要考慮的是哪個TUNEL分析最適合您的樣品類型。一些廠家為不同的樣品類型提供預先優化的試劑盒。例如，BioVision提供了適用于細胞、組織、切片及FFPE樣品的試劑盒：ApoBrdU? DNA Fragmentation Assay Kit、ApoBrdU Red? DNA Fragmentation Kit、ApoBrdU-IHC? DNA Fragmentation Assay Kit和ApoDIRECT? DNA Fragmentation Assay Kit。所有試劑盒都提供了完整的組分，包括陽性對照和陰性對照細胞或玻片，便于DNA片段化的檢測。

　　ApoBrdU 分析采用兩色的TUNEL方法，以檢測凋亡細胞的DNA鏈斷裂。ApoBrdU Red采用相同原理，但是為包含GFP的細胞設計的。ApoBrdU-IHC?則顧名思義，適合免疫組化分析。ApoDIRECT?分析則提供了凋亡細胞的一步標記，適合流式分析。

　　在處理組織時，專門的試劑盒可能更為有用，因為組織類型通常變化很大。體內的每種組織都有其獨特的結構和物理特性，這與其特定功能相關。因此，不同的組織需要不同的制備條件，以便隨后的生物學分析。為此，美國Trevigen提供了多種組織特異的試劑盒，包含了專為特定組織類型而優化的試劑和操作步驟，如適用于神經組織的NeuroTACS?、心肌組織的CardioTACS?、血管組織的VasoTACS?、腫瘤組織的TumorTACS?和皮膚組織的DermaTACS?。通過透化試劑的選擇和陽離子系統的優化，提高了檢測系統的敏感性，降低了背景和壞死細胞的著色，也大大節省了客戶優化操作的時間。目前這一系列產品也可通過R&D Systems購買，索取資料。

　　考慮通透性和標記

　　試劑的膜通透性和缺口DNA的標記，也是值得考慮的因素。過去，分析中的dUTP通常是經過生物素或熒光素標記，但最近幾年，多個廠家都推出了升級產品。他們以Br-dUTP來取代生物素或熒光素標記的dUTP，在TdT酶的作用下摻入到凋亡DNA片段的3"-末端。因為溴分子比熒光素、生物素或地高辛標記等標記物要小得多，因此Br-dUTP更容易摻入凋亡細胞的DNA片斷中，而最后的檢測信號也更強。

　　這一系列的代表產品有：默克密理博的 Apo-BrdU? Kit、Life Technologies的APO-BrdU? TUNEL Assay Kit、BD的Apoptosis Detection Kit (APO-BRDU)，以及Sigma-Aldrich的APO-BRDU? Kit等。除了Life Tech的產品采用Alexa Fluor? 488標記的BrdU抗體外，其他試劑盒均采用FITC標記的抗體。這些產品的規格均為60次檢測，價格在6000-9000元不等。

　　此外，Life Tech還獨家推出了一款Click-iT? TUNEL Assay。它采用經過炔烴修飾的dUTP，比Br-dUTP更小，因此更容易被TdT摻入。而檢測也不是基于BrdU與抗體之間的反應，而是基于點擊(Click)反應，一種銅催化的疊氮化物與炔烴之間的反應。與BrdU抗體(分子量約為150 kDa)相比，Alexa Fluor? 疊氮化物的大小僅為1%(分子量<~1000 Da)。因此只需要使用溫和的固定和透化條件，即可實現試劑的滲透。

　　據Life Tech介紹，與其他方法相比，Click-iT? TUNEL Assay在相同條件下能夠檢測更高比例的凋亡細胞。整個過程也很快，大約在3小時內完成。Click-iT? TUNEL Assay提供三種不同的熒光染料：Alexa Fluor? 488(綠色)、Alexa Fluor? 597(橙色)和Alexa Fluor? 647(紅色)。此試劑盒足夠開展1x96次檢測或50塊蓋玻片，價格為9820元。

　　考慮檢測方法

　　TUNEL分析一般采用顯色法或熒光檢測法。每一種都有其各自的優缺點，因此選擇哪一種取決于您的需求。熒光檢測感更為靈敏，但難以保留信號。由于成像時的光漂白，且隨著時間的流逝，熒光信號會逐漸喪失。熒光信號也會有更高的背景問題，這要取決于組織類型。顯色分析適用于組織切片，因為可以使用光學顯微鏡，并且您可以開展進一步的形態學分析，并永久記錄。

　　顯色檢測

　　市場上有多個顯色檢測試劑盒可供選擇，特別是原位或組織研究。羅氏就提供了四種版本的In Situ Cell Death Detection Kit，兩個熒光版本：熒光素和TMR Red;兩個顯色版本，分別利用過氧化物酶或堿性磷酸酶檢測。

　　上文也提到過，R&D Systems/ Trevigen推出了適合不同組織的試劑盒，其中包含了顯色檢測試劑和復染劑，使對比度更高。其中，TACS XL? Kit提供了兩種顯色底物，分別為：TACS-Blue Label?或DAB。TACS-Blue Label是一種即用型的檢測試劑盒，靈敏度比DAB更高，但不是永久的染料。如果組織和結果需要存檔，那還是DAB更合適。

　　此外，R&D Systems/ Trevigen還提供兩種可定量的TUNEL試劑盒，TiterTACS? 和FlowTACS?。TiterTACS?利用酶標儀測定吸光度變化，可定量特定細胞群體中的凋亡信號，適合培養中的貼壁細胞。FlowTACS則包含熒光素標記的鏈霉親和素，在與PI結合使用時，可利用流式細胞儀來定量凋亡細胞。FlowTACS適合懸浮細胞以及解離的貼壁細胞。

　　熒光檢測

　　熒光相對顯色檢測的一個好處是多重檢測，這樣能節省時間和材料，讓各個反應在相同的實驗條件下開展。這對于驗證凋亡結果特別重要。上面提到過，Click-iT? TUNEL Assay就提供三種不同顏色：綠色、橙色和紅色。Alexa Fluor? 染料可是Life Tech的旗艦產品，比其他熒光染料更明亮更穩定。

　　除了兩種熒光的In Situ Cell Death Detection Kit，羅氏還推出了一種新的DNA片段化成像試劑盒。此試劑盒可快速檢測哺乳動物細胞的凋亡，適合中等至高通量的分析。操作步驟經過改善，洗滌步驟更少，細胞損失的風險也就更低。對于一塊96孔板的分析，所需的總時間僅為85分鐘。它適用于手動的顯微鏡或自動的成像系統，如羅氏的Cellavista系統。試劑盒還提供了細胞核染料Hoechst 33342，可染色活細胞和死細胞的核，這樣即可同時確定細胞總數以及凋亡細胞的比例。

　　由此可見，TUNEL分析的選擇可真不少，大家可根據自己的樣品、儀器，參考價格、售后等因素，自由地挑選。