減數分裂制片技術

實驗概要

1、了解植物生殖細胞的形成過程；
 

2、熟悉減數分裂各時期的特點，加深對減數分裂的認識；
 

3、掌握植物花粉母細胞的壓片技術和方法。

實驗原理

減數分裂（meiosis）,又稱成熟分裂（maturation division）是在性母細胞成熟時，配子形成過程中所發生的一種特殊方式的有絲分裂。性母細胞（2n）連續進行兩次核分裂（第一次分裂和第二次分裂），形成四個染色體數目減半的配子(n)。經過受精，雌雄配子（n）融合為合子，又恢復了體細胞染色體數目（2n）。確保了親代與子代間染色體數目的恒定性，從而保證了物種相對的遺傳穩定性。
 

在適當的時候采集植物的花蕾制備染色體標本就可在顯微鏡下觀察到植物細胞的減數分裂。整個減數分裂可分為下列各個時期：
 

第一次分裂  

前期Ⅰ 減數分裂的特點之一就是前期Ⅰ特別長，而且又較復雜。通常根據細胞核內結構變化特征又將這一期分成五個時期，即細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期。
 

細線期（leptotene）：這是減數分裂的開始時期，染色質開始濃縮為細而長的絲狀，首尾不分，且細線局部可見到念珠狀顆粒，即染色粒。此時，雖然染色體已經復制為二個染色單體，但在顯微鏡下還看不出結構上的雙重性。

偶線期(zygotene)：各同源染色體開始配對（pairing），出現聯會現象。2n個染色體聯會為n對染色體。染色體形態與細線期差別不大。在顯微鏡下不易與細線期分開，但可根據染色體分散狀態及粗細變化判斷其是靠近細線期還是趨于偶線期。

粗線期（pachytene）：二價體逐漸縮短變粗，同源染色體配對完畢，這種二價體包含了四條染色單體，又稱四合體(tetrad)。此時，非姊妹染色單體間出現交換（crossing over）,造成遺傳物質的重組。

雙線期(diplotene)：配對的同源染色體進一步縮短變粗，由于同源染色體間發生過互換，開始分離而出現交叉（chiasmata）現象。此時染色體呈現扭花狀。

終變期(diakinesis)：由于交叉端化（terminalization），染色體顯著收縮變粗，并向核周邊移動，在核內較均勻地分散，二價體往往呈X、O、V形態，核膜、核仁才開始消失。此時有利于染色體計數。

另外，玉米花粉母細胞在整個前期Ⅰ都具有較明顯的核仁，這是前期的一個顯著標志，進入中期,核膜、核仁才開始消失
。

中期Ⅰ 核膜、核仁才消失,各個二價體排列在赤道面上，紡錘體形成。雙價體開始分離。此時也是鑒定染色體數目和形態的最好時期。

后期Ⅰ 由于紡錘絲的牽引，各個二價體分開，移向兩極，每一極得到n條染色體，每一染色體含有兩個染色單體。實現了染色體數減半（2n → n）。

末期Ⅰ 移到二極的染色體，解旋、松散變細，逐漸形成兩個子核，核膜重新形成，胞質分裂，成為兩個子細胞，稱為二分體（dyad）。

中間期（interkinesis）  在第二次分裂開始之前，兩個子細胞進入間期。但有的植物和大多數動物不經過間期，直接進入第二次分裂。間期的時間短，無DNA復制，故DNA含量沒有變化。
 

第二次分裂
 

前期Ⅱ 染色體縮短變粗，開始清晰起來。每個染色體含有一個著絲粒和縱向排列的兩條染色單體。前期快結束，染色體變得短粗、清晰可見，核膜消失。
 

中期Ⅱ 染色體排列在赤道面上，兩條染色單體開始分裂。此時細胞的染色體數為n，每一染色體有兩條染色單體。
 

后期Ⅱ 著絲點分裂為二，兩條染色單體由紡錘絲分別拉向兩極，每極含有n條染色體。
 

末期Ⅱ 染色體逐漸解旋，核膜重建，核仁重新形成，同時細胞質又分為兩部分，各成為兩個子細胞。
 

這樣，一個花粉母細胞經過兩次連續分裂形成四個子細胞，稱四分體（tetrad）或四分孢子(tetraspore)。各細胞的核里的染色體只有最初細胞染色體的一半，即從2n減數為n。

主要試劑

Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1）、醋酸洋紅、45%醋酸等。

主要設備

顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片等。

實驗材料

玉米雄花序（2n = 20）

實驗步驟

1、采集玉米不同花期的雄花序用新配制的Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1）固定18—24小時，經80%和70%酒精各半小時，保存于70%酒精中備用。這樣處理的材料可保存使用2—3年。
 

2、取經過固定的雄花序，選取長0.5cm左右的小花，用解剖針或鑷子挑出花藥（每一朵小花有3個花藥），置于載玻片上。

3、在花藥上滴一滴醋酸洋紅，然后用解剖針把每個花藥截成幾段，盡可能擠出花藥中的花粉母細胞。

4、去除花藥殘渣，適當涂勻玻片，蓋上蓋玻片，墊一張濾紙，以大拇指均勻按壓，注意，不要滑動蓋玻片！吸去多余染液即可鏡檢。若高倍鏡觀察顏色太深，可在酒精燈火焰上過幾遍，微燙，使細胞質透明，增大反差，注意不要拷過度！

5、顯微鏡下觀察，尋找減數分裂各期圖象，熟悉各時期特點。

注意事項

附：臨時制片與永久制片

將做好的比較理想的片子，可以臨時封片以保存一段時間，也可制成永久制片，以長期保存。

Ⅰ、臨時制片：暫時封固良好的片子，可以用解剖針燒熔石蠟密封蓋玻片四周，置低溫下一般可保存數星期。
 

Ⅱ、永久制片：

1、將制好的片子有蓋玻片的一面向下浸入95%酒精1：冰醋酸1的混合液中，從蓋玻片脫落載玻片時算起1-2分鐘。

2、輕取載、蓋玻片，不使材料丟失并注意其位置，放入95%酒精2：正丁醇1的混合液中1-2分鐘。

3，移入95%酒精1：正丁醇2的混合液中1-2分鐘。

4，移入正丁醇中1-2分鐘（至少兩次）。

5，加拿大樹膠（或中性樹膠）封存。