凝膠色譜的原理比較特殊,類似于分子篩。待分離組分在進入凝膠色譜后,會依據分子量的不同,進入或者不進入固定相凝膠的孔隙中,不能進入凝膠孔隙的分子會很快隨流動相洗脫,而能夠進入凝膠孔隙的分子則需要更長時間的沖洗才能夠流出固定相,從而實現了根據分子量差異對各組分的分離。調整固定相使用的凝膠的交聯度可以調整凝膠孔隙的大小;改變流動相的溶劑組成會改變固定相凝膠的溶漲狀態,進而改變孔隙的大小,獲得不同的分離效果。