| 實驗方法原理 | 凝膠過濾( Gel Filt ration ) 也稱排阻層析( Exclusion Chromatography)、分子篩層析(Molecular Sieve Chromatography ) 和凝膠層析( Gel Chromatography) 。凝膠一般是由葡聚糖的膠體溶液凝結而成的固體物質, 其內部具有很細微的多孔網狀結構。凝膠層析的機理是分子篩效應, 當凝膠裝柱后, 柱床容積稱為“ 總容積” ( Vt ) , 它由Vo、Vi 、Vg 三部分組成, Vt = Vo + Vg ,式中Vo 為“外水容積”, 或“ 孔隙容積”, 即存在于柱床內凝膠顆粒外面孔隙之間的水相容積; Vi 為“ 內水容積” 即凝膠顆粒內部所含水相的容積, 相當于一般層析法中的固相容積, 它可以從干凝膠顆粒重量和吸水后的重量求得; Vg 為凝膠本身的容積,Vt - Vo = Vi - Vg。“ 洗脫容積” ( Ve ) 是指自加入樣品開始到組分最大濃度( 峰) 出現時所流出的容積, 它與Vo 及Vi 關系為: Ve = Vo - Kd Vi , 式中Kd 為樣品在兩相中的分配系數, 即分子量不同的溶質在凝膠內部和外部的分配系數, 它只與被分離的物質分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小分布有關, 而與柱形狀無關, 對特定物質來說是一常數。對一層析柱凝膠床來說, 只要通過實驗得知某一物質的洗脫容積Vo , 就可求出其Kd 值, 上式可以改寫為Kd = ( Ve - Vo ) / Vi , 式中Vo 可用不被凝膠滯留的大分子物質溶液求得, 如藍色葡聚糖-2000 ( MW =2000000 U) , 血紅蛋白, 印度黑墨水等; Vi 可用g·Wr 求得( g為干凝膠重, Wr 為凝膠的吸水量, 以ml/ g 表示) 。 目前使用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠及瓊脂糖和葡聚糖組成的復合凝膠。這些凝膠具有以下特點:化學性質穩定, 不與待分離物質發生反應, 沒有或只有極少量的離子交換劑基團, 且有足夠的機械強度。本實驗用的是葡聚糖與還氧化氯丙烷通過交聯反應制成的有孔顆粒狀凝膠。交聯程度越大孔徑越小, 它不溶于有機溶劑, 能在水和電解質溶液中迅速溶漲。
不同型號的葡聚糖凝膠用英文G 表示, 如G-25、G-50、G-75、G-100 等, 后面的數字為凝膠吸水量乘以10。在實際工作中, 超細顆粒主要用于分辨率十分高的柱層析中, 細顆粒用于制備, 中等和粗顆粒用于低操作壓下高流速的制備柱層析。根據凝膠層析的原理, 同一類型化合物的洗脫特征與組分的分子量有關, 流過凝膠柱時, 按分子大小順序流出, 分子量大者走在前頭。通常以Ka v ( Kd ) 對分子量的對數作圖可得一曲線,稱“ 選擇曲線”, 曲線的斜率是凝膠性質的一個重要特征, 在一定范圍內, 曲線愈陡分級愈好。在測定分子量時, 使用曲線的直線部分為宜。
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| 實驗步驟 | 1. 緩緩攪拌Sephadex 懸浮液, 然后慢慢倒入預先置好的層析柱中, 使凝膠床達到2 . 5 cm×30 cm, 上端出口管用螺旋夾控制。千萬不能產生氣泡。當凝膠已完全沉降后, 控制凝膠床上面的液面在5 cm 左右。
2. 接著將待分離物質加到層析柱的上端(柱床上端的液面降至使凝膠剛好露出為止) , 用移液管吸取待分離的樣品, 并使移液管尖端的位置大約在膠床上方的1 cm 處, 持好移液管, 勿變動位置, 然后緩慢而連續地將樣品釋放到凝膠床上層。移開移液管, 用10 ml 的試管放在部分收集器上收集從柱下端流出的溶液, 此時控制流速在每4 秒鐘1 滴( 相當于60 ml/ h )。
3. 當樣品液剛好完全流入凝膠床時, 向柱上端很小心地添加緩沖液至合適高度, 以保證流速的穩定。注意, 切勿攪動柱上端的凝膠, 也不能使凝膠床上端無充裕的緩沖液甚至干涸。
4. 先收集28 ml 流出液, 再開始按每管4 ml 收集, 連續收集并對每管編號, 當所有的有色物質均從層析柱中洗脫下來后,關閉螺旋夾停止洗脫。然后在對應的波長下讀各管的光吸收值。葡聚糖( 650 nm 藍色) ; 肌紅蛋白( 500 nm 琥珀色) ; DNP-天冬氨酸( 440 nm 黃色)。
5. 洗脫完最后一個譜帶( 黃色) 后, 將1 ml 未知樣品溶液加到層析柱內, 先收集28 ml , 然后按前述方法開始每4 ml 一管連續收集。如果蛋白質無色, 就在280 nm 波長條件下讀光吸收值。
【結果計算】
Kd 值的計算: 利用每管的光吸收值對管的編號數作圖( 注意前7 管里以28 ml 一次收集的, 第一個4 ml 管的編號應為8 ) ,應在每個峰位置標出測量波長, 畫一個坐標圖, 用觀察法或算術平均法確定每個峰的確切位置。算術平均法的計算式: 峰中點=峰內每管編號乘以峰內連續各管的光吸收值之和, 再除以峰內連續各管的光吸收值。
對1 ml 未知樣品也按上述法做。計算出肌紅蛋白的Kd 和未知樣品的Kd 值。
肌紅蛋白和未知樣品分子量的估算: 利用下表數據, 用已知蛋白質的Kd 值(縱坐標) 對lgMW 作圖, 再算出肌紅蛋白和未知蛋白的分子量。
在圖中適當位置標明肌紅蛋白和未知樣品的Kd 和MW。
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