凝膠阻滯實驗（gel reiardadon assay，又稱為 mobthty shift assay）方法簡單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉錄和基因調控中廣泛的應用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 結合蛋白的純化，確定一種已知或可能的 RNA 結合蛋白所識別的序列，建立反應常數（如親和常數和解離常數）等。在本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 凝膠阻滯實驗（gel reiardadon assay，又稱為 mobthty shift assay）方法簡單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉錄和基因調控中廣泛的應用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 結合蛋白的純化，確定一種已知或可能的 RNA 結合蛋白所識別的序列，建立反應常數（如親和常數和解離常數）等。 |
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| 實驗材料 | 待分析蛋白質RNA |
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| 試劑、試劑盒 | 結合緩沖液電泳儲存液 |
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| 儀器、耗材 | 電泳儀電泳槽玻璃板墊片梳子聚丙烯酰胺凝膠電泳X 射線片暗盒放射物質劑量計 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. 標記 RNA 片段、未標記的同種 RNA。
2. 待分析蛋白質。
3. DEPC 處理的水。
4. 10X 結合緩沖液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，10% 甘油，1 mg/ml 牛血凊白蛋白。2X 此緩沖液的儲存液也可以選擇使用。
5. 釆用標準的電泳儀、電泳槽、玻璃板、墊片和梳子進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。
6. 電泳儲存液和試劑：40% 丙烯酰胺，2% 甲叉雙丙烯酰胺，80% 甘油，4X Tris 甘油緩沖液（1X 緩沖液為 25 mmol/L 的 Tris 堿，0.2 mol/L 的甘油），過硫酸銨，TEMED。
7. X 射線片、暗盒、相應的放射物質劑量計。
二、操作方法
1. RNA 和蛋白的結合反應
(1) 冰浴，微量離心管中加入下列試劑，并混勻：末端標記的 RNA 片段 1 ng，10X 結合緩沖液 2 μl，末標記的同種 RNA 適量，待測蛋白 適量，加水至 20 μl。
(2) 37°C 溫育反應液 30 min，溫度和時間需要通過經驗確定，對于大多數反應，30 min 足夠達到平衡。
2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
(1) 凝膠可以提前制備。用水和乙醇徹底淸洗玻璃板，使用 0.7 mm 薄墊片，12 齒梳子，每齒的尺寸為 0.8 cm X 1.5 cm，玻璃板的尺寸為 18 cm X 23 cm。
(2) 混合適當的儲存液得到 40 ml 的溶液，含有 6% 丙烯酰胺、0.12% 甲叉雙丙烯酰胺、25 mmol/L Tris 堿，0.2 mol/L 甘氨酸、5%甘油，加入 15 mg 過硫酸銨和 TEMED，灌注到兩玻璃板之間，插入梳子，深度為 1~1.2 cm，等到完全聚合，在最后的電泳溫度平衡凝膠。
(3) 去掉底部的墊片，將凝膠裝到電泳槽，在頂部和底部槽中加入電泳緩沖液（25 mmol/L Tris 堿和 0.2 mol/L 甘氨酸），用吸管吹打毎個孔確保孔中的凝膠底部任何空間的氣泡被去除，在上樣以前 300V 預電泳凝膠不少于 30 min。
(4) 上樣，300V 電泳 3 h。
(5) 倒空電泳槽，取下凝膠。所有的放射性物質，包括 RNA 標記反應時未結合的核苷三磷酸仍然留在凝膠中，底部槽中的緩沖液應該沒有放射性，但是任何試驗參數發生了改變，必須測定底部糟中的緩沖液有沒有放射性（在任何情況下此操作都很有必要）。去掉一個玻璃板，依據定量的方法不同，凝膠可以置于 Whatman 濾紙上在凝膠干燥器中干燥，固定（12% 甲醇，10% 的乙酸）或直接用塑料膜包裹濕的凝膠直接進行定量。
3. 結果的定量
確定各個條帶中對應的游離 RNA 和結合 RNA 放射性物質的量，方法有以下幾種：
(1) 放射自顯影和光密度測量法。濕的或者是干燥的凝膠都可進行 X 射線片顯影，放射自顯影的結果可以采用光密度掃描進行分析，該方法最大的缺點是 X 射線片定量本身固有的低線性反應范圍可導致定量的巨大誤差，如果使用此方法，必須建立一個標準的 曲線將光密度單位轉換為放射物質的計量單位，以減少 X 射線片非線性反應帶來的誤差。
(2) 濕的凝膠可以直接進行 X 射線片的曝光，隨后進行凝膠上條帶的定位，這些條帶可以切下來在液體閃爍計數儀上記數。該方法盡管可以避免 X 射線片光密度非線性問題，但是比較煩瑣，而且在切膠時容易產生誤差。
(3) 感光成像分析技術。干燥的凝膠可以曝光磷屏，然后使用商品化的感光成像儀和相應的分析軟件進行處理和分析，該方法準確，優于前面所述的方法。
(4) 直接檢測 β 粒子放射。從凝膠上直接檢測 β 粒子放射的儀器可從公司購買（Amibis/Scanalytic 公司，BetaScope 公司和 Packard 公司），這些儀器的分辨率通常沒有感光成像分析技術高，但是可以滿足凝膠阻滯試驗的數據分析，通常只需要短時間掃描就可以完成凝膠上標記 RNA 的定量。
無論使用哪種方法定量，最終的結果必須能夠代表結合或者游離 RNA 中放射物質的量，只要與試驗相適應可以使用任意單位。在電泳時可能會發生 RNA-蛋白復合物分離情況，造成在低遷移率的復合物前面有放射性物質的彌散，這些彌散的放射性物質應該計算到 RNA-蛋白復合物里。 |
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