凝集素去除半抗原糖

　　蛋白質糖基化的檢測實驗

　　實驗方法原理

　　用酶或化學脫糖基化、通過選擇性標記或通過凝集素親和層析法是檢測蛋白糖基化常用方法。

　　實驗材料

　　蛋白樣品

　　試劑、試劑盒

　　磷酸鈉緩沖液 蛋白溶液 β-巰基乙醇 NP-40 溶液

　　儀器、耗材

　　SDS-PAGE 玻璃器皿 植物凝集素柱

　　實驗步驟

　　一、用 PNGaseF（N-多糖酶）處理

　　 以 0.1 mol/L 磷酸鈉（或 Tris-HCl，而不用檸檬酸）緩沖液，pH 7.4 ( 7.0~8.0 ) 配制高達 2 mg/ml 的蛋白溶液，并含 50 mmol/L β-巰基乙醇和 0.1% SDS，在水浴中煮沸 2 分鐘。加 1/10 體積的 10% NP-40 溶液（或使 SDS 濃度少于或等于 0.17%，NP-40：SDS 的質量比在終反應中至少是 7:1)。加 PNGaseF 到終濃度為 6 mU/ml。注意這里的 1U 相當于在 1 分鐘形成的 1 微摩爾產物；--些廠家用 1U = 1 nmole/分 在 37℃ 中保溫 16 小時，以完全脫糖基化。用 TCA/DOC 按照下列步驟沉淀以制備 SDS-PAGE 樣品。

　　(1) 在樣品中加等體積的含 50% TCA 的 10 mmol/L DOC 溶液，并且在冰上放置 20 分鐘。

　　(2) 以最大速度（16000 g)，4℃ 下離心樣品 15 分鐘。

　　(3) 用冷丙酮清洗沉淀一次，并再次離心樣品。

　　(4) 用 SDS-PAGE 樣本緩沖液重懸最后的沉淀，如有必要，可用小體積的 1 mol/L Tris pH 8.0。將懸液調至 pH 8.0 樣品上樣至凝膠上進行電泳。

　　二、用 EndoH 處理

　　 在 100 mmol/L、pH 5.5 的檸檬酸鈉緩沖液中制備濃度達到 1 mg/ml 的蛋白樣品。用 10 mU/ml 酶 37℃ 消化樣品過夜。按常規的方法處理樣品用于 SDS-PAGE 分析。

　　三、酶去除 O -多糖

　　 二甲胂酸鈉（磷酸鹽或馬來酸鹽，但不是 Tris-HCl ) 中制備濃度 5 mg/ml 的蛋白，pH 6~7.6。用 10 mU/ml 的酶消化樣品，在 37℃ 孵育過夜。按照 PNGaseF 第 4 步所述的方法（TCA/DOC 沉淀）處理反應混合物以進行 SDS-PAGE。

　　四、來自產脲節桿菌的唾液酸苷酶

　　 以 pH 5.0、50 mmol/L 醋酸鈉制備 0.5 mg/ml 的蛋白溶液。加 10 mU/ml 的唾液酸苷酶，37℃ 下保溫 12~16 小時。制備樣品用于 SDS-PAGE 分析。

　　注意事項

　　 一個特殊的、未經分級的“脫糖基化級”PNGaseF和EndoF混合物可以從一些廠家買到。如果要用對碳水化合物特異的檢測方法檢測脫糖基化，應該記住：EndoF在一些糖基化位點上會留下抗-PNGaseF的GlcNAc基團。放射標記的蛋白對植物凝集素親和層析是特別有用的，因為結合和洗脫的檢測能夠用液閃計數迅速獲得。然而，如果可能，這些結果一定要通過電泳確證。對于蛋白純化，植物凝集素余和介質被證明是有用的，既可以保留住目的蛋白，也可以除去大部分不同糖基化的蛋白。如果需要去除半抗原糖，用來脫鹽的凝膠過濾柱子通常就足夠。