幾種典型掃描電鏡生物樣本制備

隨著科學技術的發展，掃描電子顯微鏡技術已成為檢測物質性能和表征微觀結構的重要手段，被廣泛應用于食品學、生物學、醫學、高分子材料等領域[1]。掃描電子顯微鏡在科學研究中有廣泛應用，如觀察不同淀粉顆粒的超微形貌[2]、蛋白復合膜的微觀結構[3]、淀粉納米顆粒的研究[4]及不同儲藏過程中肉食類微結構的變化[5]等。相較于傳統的光學顯微鏡和透射電鏡，掃描電鏡具有以下特點：直接多角度觀察樣品的表面結構；不需要將樣品切成薄片；景深大、圖像立體感強；放大倍數從幾十倍到幾十萬倍連續可調；電子束能量較低，對樣品的損傷小；在觀察形貌的同時可以對微區的成分進行定量和定性分析。
　　掃描電鏡同樣對于樣品有一定的要求，需要滿足以下條件：①導電性能好，樣品在電子束的作用下表面電位不會升高，不會產生荷電效應[6]；②樣品要盡可能干燥，電子束在真空狀態下運行，若樣品中含有水分，水分揮發會造成圖像漂移，損傷光闌和燈絲等[7]；③熱穩定性好，避免在電子束作用下樣品分解，釋放出氣體或其他物質，污染鏡筒；④樣品不能有磁性。粉末樣品尤其是超微粒子，吉普斯自由能較大[8]，在樣品制備過程中需克服團聚現象，且使樣品有一定的密度[9]。生物樣品具有含水量高、導電性差等特點。生物樣品的含水量一般為70%～80%，只有少數的樣品，如花粉、毛發等可以直接放入掃描電鏡中觀察，大部分生物樣品需要經過脫水干燥處理后才能進行觀察[10]。因此生物樣品制備的關鍵步驟是干燥，應盡量減少因水分蒸發導致的形變。因此掃描電鏡的樣品制備方法對于電鏡的觀察非常重要[11]，能否獲得真實、清晰、理想的掃描電鏡圖片，樣品制備方法非常關鍵。
　　本試驗研究了12種典型樣品（包括普通粉末材料、納米材料、微生物、植物和動物）的掃描電鏡制備方法，對掃描電鏡樣品制備方法進行全面闡述，同時對其他方法進行了改進，為同類樣品的掃描電鏡樣品制備提供參考。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 粉末樣品 淀粉顆粒，淀粉納米顆粒。
　　1.1.2 生物樣品 金黃色葡萄球菌（球菌）、大腸桿菌（桿菌）、放線菌（真菌）、青島老鸛草（陸生植物）的花粉、睡蓮（水生植物）的花粉、絞股藍的葉片、玉米莖稈、青島百合的花芽、雞血和雞氣管等。
　　1.1.3 主要儀器 JFC-1600型離子濺射儀、JFD-320型冷凍干燥機、Emitech K850型二氧化碳臨界點干燥儀、JSM-7500F場發射掃描電子顯微鏡。
　　1.1.4 所用試劑 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）、2.5%戊二醛溶液、1%四氧化鋨溶液、FAA固定液、乙醇、丙酮、醋酸異戊酯、叔丁醇等。所有試劑均為分析純，試驗用水均為去離子水。
　　1.2 方法
　　1.2.1 牙簽直接固定法 將雙面導電膠帶粘到樣品臺上，用牙簽蘸取待測樣品，輕輕用手指將牙簽上多余的樣品彈掉。然后將牙簽輕輕在雙面膠上滾動，使樣品顆粒均勻地涂布到導電膠上。用洗耳球輕吹試樣，除去未附著的或者沒有固定牢固的顆粒。
　　1.2.2 銅片固定法 取少量樣品置于離心管中，加入適量的乙醇，將剪成0.5 cm×0.5 cm大小清洗過的銅片放入離心管中，超聲15 min后，用鑷子將銅片取出，然后將附著有樣品的銅片放在濾紙上，自然干燥，用導電膠水將銅片固定在樣品臺上。
　　1.2.3 銅網碳載膜撈取法 取少量樣品置于離心管中，加入合適的分散劑（常用的分散劑有乙醇、丙酮、水或者0.1% SDS水溶液，分散劑的選擇標準：①樣品不能溶解在該試劑中；②易揮發，超聲15 min后，用鑷子取一片附有碳膜的銅網，輕輕撈取樣品，立即放在銅網盒中置于-20 ℃冰箱中預冷20 min，放入冷凍干燥機中干燥樣品3 h左右，樣品完全干燥后取出銅網，用導電膠水將銅網粘到樣品臺上。
　　以上3種方法制備完成后，導電類粉末可以直接進行掃描電鏡觀察，不導電的粉末樣品需噴金導電處理后進行觀察。
　　以上樣品的具體處理方法見表1。
　　1.2.4 球菌（金黃色葡萄球菌）和桿菌（大腸桿菌）的掃描電鏡樣品制備 取培養至穩定期或對數生長后期的菌液2～3 mL，8 000 r/min離心3～5 min，棄上清，加入40倍菌體體積的2.5%戊二醛固定液，置于4 ℃冰箱中固定2 h以上，用磷酸鹽緩沖液沖洗2～3遍，依次用50%、70%、90%和100%乙醇進行梯度脫水，每次脫水時間為5～10 min。脫水結束后，用乙醇-叔丁醇溶液（1∶1，V/V，下同）置換20 min，最后用100%叔丁醇置換兩次，每次20 min。置換后將樣品進行冷凍干燥處理，干燥后的樣品進行離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。
　　1.2.5 放線菌的掃描電鏡樣品制備 在固體培養基中培養放線菌，用鑷子將滅菌處理的蓋玻片以45°夾角插入培養基中，讓細菌爬片生長。將蓋玻片輕輕拔出，用磷酸緩沖液將蓋玻片上多余的培養基洗掉。將蓋玻片放到預裝有2.5%戊二醛溶液中（有菌絲的一面朝上），室