實驗概要
本文介紹了三種多聚螯合物酶法：PowerVision法，ELPS法和EPOS法。
實驗原理
1. PowerVision系統的原理是連接抗體上緊密地連接上許許多多的酶分子，呈串珠狀排列，由于利用了一種小的呈線性或很小枝狀多功能試劑作為骨架分子，與酶和免疫球蛋白交聯，排列緊密，形成串珠狀多聚物，因此相對分子質量較小。其特點是簡便、敏感。其操作流程同EnVision法，但一抗的稀釋度可在EnVision法基礎上作進一步。
2. EnVision法又稱為ELPS法(enhance labeled polymer system)，抗原—抗體反應結合后，第二抗體上標記有多聚化合物(葡聚糖)酶復合物(EnVision復合物)，與第一抗體結合，進而由酶作用底物進行顯色定位。EnVision復合物是利用一種多聚化合物將HRP或AKP和第二抗體(抗鼠或抗兔IgG)同時標記在一個多聚化合物上，即形成酶—多聚化合物—第二抗體巨大復合物。每1個分子的復合物中約含10個分子的HRP和10個分子的第二抗體，復合物中的HRP的絕對數量遠高于其他復合物(如ABC)，本身已具備高度放大作用，因此EnVision法敏感性顯著高于其他方法。復合物中存在多個第二抗體，也增加了該復合物與特異性抗體的結合機會。同時，人體內不存在該多聚化合物，無非特異性干擾，故背景染色淺。此外，染色步驟為兩步，且第二抗體孵育時較短，使該方法更省時而簡便。
3. EPOS法原理是采用一種具有惰性的多聚化合物(葡聚糖)為骨架，將特異性抗體和HRP結合在一起，形成HRP-多聚化合物-特異性抗體巨大復合物，該復合物內不含第二抗體及親和素。染色時，只需在組織切片上加入相應的酶標記特異性抗在組織切片上加入相應的酶標記特異性抗體EPOS試劑，孵育30～60min即可完成。勿需再加酶標記第二抗體。
實驗步驟
1. PowerVision法
1) 4um常規石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3minX3次。
2) 預處理組織切片(可用酶消化或AR或不作任何處理，依一抗質量而定)。
3) PBS洗3minx3次。
4) 0.3％H2O2阻斷內源性過氧化物酶15min，PBS洗3minX 3次。
5) 適當稀釋特異性一抗，室溫孵育1h，PBS洗3minX3次。
6) 滴加山羊抗小鼠(或兔)IgG-HRP多聚物(PowerVision)，室溫孵育30min，PBS洗3minX3次。
7) 0.04％DAB-0.03％H2O2顯色8-12min。
8) 水洗后，蘇木精襯染1～3min，水洗藍化5～10min，鹽酸乙醇分化5s，水洗5min，系列乙醇脫水，常規樹膠封片。
9) 觀察結果。
2. EnVision法
1) 4um常規石蠟切片經烤片后，常規二甲苯、乙醇脫蠟至水，PBS洗3minX3次。
2) 預處理組織切片(可用酶消化或AR或不作任何處理，依一抗質量而定)。
3) PBS洗3minX3次。
4) 0.3％H2O2阻斷內源性過氧化物酶15min，PBS洗3minX 3次。
5) 適當稀釋特異性一抗，37℃孵育幾，PBS洗3minX3次。
6) EnVision復合物(即用型)孵育30min，PBS洗3minx3次。
7) 水洗，復染，常規樹膠封片。
8) 結果觀察。
3. EPOS法
1) 4um石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗3minX3次。
2) 蛋白酶消化或抗原修復(AR)，PBS洗3minX3次。
3) 0.3％過氧過氫(H2O2)處理5min。
4) 蒸餾水洗，置于PBS中洗5min。
5) 加入相應的DakoEPOS／HRP試劑，室溫孵育30～60min。
6) PBS洗3minX3次。
7) 0.04％DAB-0．03％H2O2顯色8～12min。
8) 水洗，復染，常規樹膠封片。
EPOS法只需1次孵育，是目前最簡便的方法。其特異性較高，基本無背景染色，敏感性雖然不如其他二步多聚螯合物方法，但符合一般工作需要。EPOS法不足之處是現有商品化的酶標記特異性抗體的品種不全，目前只有20余種。此外，試劑價格昂貴，尚不能廣泛推廣應用。
附 件 (共3個附件,占77KB)
2.jpg
28KB 查看
1.jpg
28KB 查看
3.jpg
21KB 查看