分光光度法朗伯比爾定律

一、分光光度法（spectrophotometry）

分光光度法是利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的一項技術，此技術靈敏、精確、快速和簡便，為生物化學研究中廣泛使用的方法。

（一）分光光度法的基本原理 

    基本原理是朗伯-比爾定律（Lambert-Beer’sLaw），又稱吸收定律，即當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時，其吸光度（absorbance，A）與吸光物質的濃度（consenreation，C）及吸收層厚度（length，L）成正比, 用公式表示為

A = ε C L

其中A為吸光度，ε為摩爾吸光系數，C為吸光物質濃度，L為吸光溶液的厚度。

光波是指波長在0.3~3 μm之間的電磁波（圖1-1），顏色跟波長和頻率有關，分為可見光和不可見光（表1-1）。可見光指能引起視覺的電磁波，波長在400-700 nm，其中紫光頻率最大，波長最短，紅光恰好相反。不可見光主要包括紅外線、紫外線、倫琴射線。發射光的物體叫做光源，光源分為自然光和人造光。按照發光原理分為輻射發光、電子發光、化學發光、生物發光等。

（二）分光光度法的應用

1．定量分析 待測樣品濃度的測定在實際工作中，由于盛放溶液的比色杯厚度是一致的，待測物質的濃度可通過以下幾種方法測得：

（1）標準比較法（standard comparative method）：在相同條件下，配制標準溶液和待測樣品溶液，測定它們的吸光度。比較兩者的吸光度，即可求出待測樣品溶液的濃度。

（2）標準曲線法（standard curve method）：配制一系列濃度由小到大的標準溶液，測出其吸光度。以各標準溶液的濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標，在方格坐標紙上繪出標準曲線。在相同條件下測出待測樣品的吸光度后，從標準曲線上可以直接查出其濃度。此法通常適用于大批樣品的分析。

（3）標準系數法（standard coefficient method）：多次測定標準液的吸光度后，按下式求出標準系數。

標準系數 = 標準液濃度/標準液平均吸光度

也可從標準曲線上求出標準系數，再用同樣方法測定待測溶液的吸光度，并代入下式求出待測物質的濃度。

C_待測= A_待測×標準系數

（4）回歸分析法（regression analysis）：將制作標準曲線的各種標準液濃度，與其相應的吸光度，用回歸分析法求出一個回歸方程式。以后，只要測定條件不變，將樣品液吸光度值代入該方程式，則可算出樣品液的濃度。

2．定性分析將各種不同波長的單色光分別通過一定濃度物質的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制吸光度-波長曲線，此曲線稱為吸收光譜曲線。各種物質都有它自己一定的吸收光譜曲線，因此應用吸收光譜曲線可對有機化合物、生物物質和藥物等進行某些特性或結構分析。當將一種未知物質和已知物質的吸收光譜曲線比較時，若二者相同，可推斷它們是同一種物質，從而對該物質作出鑒定。

3．物質純度分析：分光光度法也可用來測定物質的相對純度。例如DNA純品的A₂₆₀/A₂₈₀為1.8，若比值高，說明含有RNA；比值低說明有蛋白質存在。RNA純品的A₂₆₀/A₂₈₀為2.0，比值低于1.7時，說明有蛋白質污染。

（三）分光光度法的誤差

1．溶液濃度待測物質溶液的濃度過高或過低都會偏離郎伯-比爾定律，影響檢測的準確度。一般情況下，待測物質溶液濃度的吸光度在0.1~0.8之間最符合光吸收定律，此時檢測線性好，讀數誤差小。如吸光度不在此范圍，可適當稀釋或濃縮比色溶液再進行測定。

2．干擾物質某些物質能干擾待測物質顯色反應過程，或其本身具有與待測物質相同或相似的光吸收特性。這些物質存在于待測溶液中時，會使溶液測定值與待測物質實際濃度不相符合，因而產生誤差。

3．反應條件溶液pH、環境溫度和顯色時間等反應條件的改變，都會引起待測物質的結構或成份發生變化，從而使溶液顏色的深淺度發生改變，進而產生誤差。

4．反射光與散射光待測溶液與參比溶液的光折射率不同時，會引起發射損失的不同。待測溶液渾濁，入射光通過時會產生散射效應。這些非吸收作用都會產生測量誤差。

5．狹縫寬度分光光度計單色器分出來的單色光是通過狹縫截獲的，如果狹縫的質量不好或開得過大，所截獲的單色光的單一性差，雜波會與測定光波一起通過待測溶液，干擾測定，產生誤差。

6．儀器噪聲分光光度計的噪聲主要由光源強度、電子器件和光電管所產生的。儀器噪聲過大，可嚴重影響測定的靈敏度和準確度。

7．吸收池吸收池的不匹配、透光面不平行或定位不準確等，都會使其透光率產生差異，使測定結果產生誤差。