分子互作江湖（上）：門派林立市場火爆

　　認知自然界的本質一定要了解相互作用，先輩們已總結了4種基本相互作用：引力相互作用、電磁相互作用、強相互作用和弱相互作用。就生命科學涉及的分子研究尺度而言，主要研究的是后兩種相互作用。人們已經發展了ELISA、免疫共沉淀等一些經典的分子互作方法，但其只能描述終點。新型的分子互作儀器可以研究實時、動態的相互作用，不僅可以在研究層面更好揭示分子相互作用的機理，支持高分文章頻現；而且有力支撐生物制藥產業的發展，因其在新藥篩選中大幅提升效率，降低新藥開發成本。近年來，分子互作市場迅猛增長，據樂觀估計2028年其全球市場將接近20億美元。市場一路高歌，江湖派別林立，接下來本文將首先捋一下分子互作的主流派系和市場概況。

分子互作示意圖：蛋白和DNA互作

分子互作概述

　　生物分子的活性和功能是通過分子間的相互作用來實現的。人們習慣稱分子相互作用的一方為受體（主體），另一方為配體（客體），受體與配體之間的作用，會引起生物、化學、物理等性質的變化；分子互作技術就是利用物理、化學或光學等檢測手段，對這種肉眼無法捕捉的變化，從動力學、親和力及熱穩定性角度進行表征和測量，表征方式包括結合常數、結合的配比、結合位點、作用方式、自由能變等，其中結合常數是表征相互作用強弱最重要的參數之一。從廣義上說，主客體的相互作用主要研究小分子之間、大分子之間、小分子與大分子及分子組裝體之間的結合。其相互作用方式包括共價作用和非共價作用，其中非共價鍵力的弱相互作用力包括范德華力、親水一疏水相互作用、靜電力和氫鍵等。

　　從傳統方法來看，在蛋白質相互作用的研究方面，常用傳統方法如：酵母雙雜交、免疫共沉淀（Co-IP）、酶聯免疫（ELISA），熒光共振能量轉移（FRET），免疫印記（Western, Far-Western）、質譜等等。在涉及核酸相互作用的研究方面，常用傳統方法如：EMSA，ChIP （染色體免疫沉淀法，Co-IP的類似技術）。傳統方法的難點在于不夠準確、費時費力、大都只有終點測定。

　　SPR表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)儀器的發明，開啟了蛋白質相互作用研究的新方向。它特異準確、能定性和定量、最難能可貴的是，它可以描述分子間相互作用的動態過程（結合動力學），而不只是終點測定，這點尤其難能可貴。比如某種藥結合蛋白較快，但很快就解離，需要多次給藥；而另一種藥結合蛋白較慢，解離也很慢，一次給藥延續時間很長。對結合過程的描述可以指示藥效和給藥方式的不同。

不同的結合與解離速率反映了不同的作用機制，也決定了分子不同的功能與結構特征

　　沿著SPR準確且可測定動力學過程的思路，科學家又發明了多種新技術，如生物膜干涉（Bio-Layer Interferometry, BLI）、光柵耦合干涉技術（Grating-Coupled Interferometry，GCI）和等溫滴定微量熱（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）等非標記的技術。當KD值作為描述結合動力學的主要參數后，標記技術也登上分子互作分析的舞臺，比如微量熱泳動（MicroScale Thermophoresis, MST）和光譜位移技術（Spectral Shift）。

　　分子互作儀主要測定參數包括：

　　描述親和力（Affinity），用解離平衡常數（KD），KD描述配體和分析物分子之間的結合強度，生物學意義是，當1:1結合時，讓50%A分子飽和時B分子的濃度。濃度單位M，數值越小結合越強。對于SPR來說，KD=kd/ka，其中kd是分析物與配體之間的解離速率，ka描述分析物與配體之間結合的速率。

　　表征儀器主要性能的指標還有：測定的靈敏度、目標分子活性含量(Concentration)、單次實驗的時間，以及多通道、高通量測定的能力等。

分子互作代表技術及原理

表面等離子共振技術SPR

　　經典SPR

　　1902年，Wood在光學實驗過程中發現了表面等離子共振（SPR）現象：當電磁波射向金屬表面時，其反射光譜會產生異常，表現為在特定角度下反射光強度明顯下降，光譜上出現明顯的暗帶，而且金屬膜表面折射率的變大會導致暗帶位置發生變化。1968年科學家解釋了該現象：SPR現象來源于消逝波和金屬表面等離子波的共振。1990年，Biacore AB公司（現隸屬丹納赫旗下Cytiva）開發了首臺商品化SPR儀器Biacore。

　　SPR技術原理：當光從光密介質射向光疏介質，入射光滿足一定條件時會發生全反射現象。從波動光學的角度來研究全反射，入射光到達界面時并不是直接產生反射光，而是先透過光疏介質約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質，而光的總能量沒有發生改變，透過光疏介質的波被稱為消逝波。由于金屬中含有自由電子，可以看作一種等離子體，入射光激起電子的縱向振動，振動產生的電荷密度波，沿著金屬和電介質的界面傳播，形成表面等離子波。金屬表面等離子波與消逝波發生共振時，檢測到的反射光強度會大幅度地減弱（能量幾乎接近零）。當入射光波長固定時，反射光強度是入射角的函數，其中反射光強度最低時所對應的入射角為共振角，即SPR角。

　　Biacore的傳感器由表面涂有一層薄金膜的玻璃片構成，大多數應用中金膜上覆蓋的是葡聚糖基質，葡聚糖不僅可以作為固定分子的基底，還能為相互作用提供親水環境，亦可使用其它基質固定特定類型的分子，Biacore提供十余種不同芯片。一個互作分子（配體）偶聯在傳感器芯片的表面，另一個（分析物）通過連續流系統輸送到芯片表面。

　　SPR本質是一種折射率傳感器。SPR使從傳感器表面的玻璃側以特定角度反射的光強度降低，當分子結合到傳感器表面時，傳感器表面的折射率發生變化，改變了最小反射強度的角度，SPR角度的變化與結合物質的質量成正比。當樣品溶液流過芯片時，對反射指數變化的檢測結果構成傳感圖，其中Y軸上的結合響應值與X軸上的時間相對應。由于光線不會穿透到樣品側，因此可以對有顏色的、混濁的或不透明的樣品進行分析。通過分析所生成的傳感圖，可以測定是否結合、特異性、親和力、動力學和活性濃度。傳感圖提供了整個相互作用過程的實時信息。更多原理視頻

SPR工作原理

　　SPR的優點是經典，分子量最低檢測限從100Da到無限制，靈敏度高，應用范圍廣；缺點是儀器光路、微流控流路相對復雜。SPR技術在國際上得到了充分的認可，最新版的美國藥典（USP39）、日本藥典（JP17）、2020年版《中華人民共和國藥典》都將SPR技術作為分子互作分析“金標準”技術。

　　LSPR局域等離子共振

　　在經典SPR之上，人們發展了LSPR局域等離子共振技術。當入射光子頻率與貴金屬納米顆粒傳導電子的整體振動頻率相匹配時，納米顆粒會對光子能量產生很強的吸收作用，發生局域表面等離子體共振現象（LSPR），當溶液中的分子與固定的探針結合引起生物分子層厚度的變化，從使LSPR吸收峰發生位移，LSPR檢測方法可對這種即時變化（吸收峰的位移及波長變化）做動態檢測。

LSPR局域等離子共振技術示意圖

　　納米膠體金傳感器(1.5mm2)比傳統金膜小，相較SPR技術，LSPR具有成本低、靈敏度高等優勢。首先，傳統SPR使用持續金膜，而LSPR采用納米金顆粒感應器，在可見光范圍內可產生很強的共振吸收峰，使得顆粒周圍的局域折射率高度敏感，從而對位置具有高靈敏度，能檢測出吸收位置范圍內非常小的波長改變，這與傳統SPR的角度檢測有很大區別。其次，LSPR的衰減波長比SPR小，更小的感應體積意味著LSPR對分子偶聯更靈敏，而體積改變對檢測的影響也會相應更小，甚至系統受外部變化如溫度漂移，緩沖液折射率改變等人工因素的干擾程度也會大大降低，從而進一步保證了實驗結果的高精確度。

　　3D納米SPR——MetaSPR

　　在原有SPR技術基礎上，中國的量準公司開發了MetaSPR技術。納米杯陣列表面等離子體共振（Nanocup Array-enhanced SRP）原理是：當入射光照射到表面光學金屬納米結構時，可引起金屬自由電子的共振，由于電子共振致使光的二次發射，從而形成特定的反射光譜。芯片表面的分子或溶液的變化會導致特定波長處等離子共振的反射光強度發生改變。當反射光譜發生位移后的波長減去位移之前的波長時，在某一波長光的強度顯著降低，某一波長強度顯著上升。因此可以通過獲取生物反應過程中兩波長的反射光強變化，得到分子互作信號（感覺比LSPR更向前了一步），這與傳統基于SPR入射光角度變化的技術是不同的。

MetaSPR技術原理示意圖　　

　　MetaSPR將光學芯片由原來的二維基膜變成了三維基膜。與傳統SPR的平面膜芯片相比，MetaSPR芯片的納米孔陣列的電磁衰減長度( ld )要短得多，可大幅度降低樣本的Bulk效應，適合復雜樣本以及未經純化的粗樣本。此外，三維基膜的芯片將信號放大了千倍以上，帶來更高的檢測靈敏度和更低的分子濃度檢測下限。同時，也不再需要傳統復雜的光路系統來捕捉微弱的信號，變成了簡單的LED光源和光電二極管，這極大簡化工藝路徑，從而降低成本。

　　SPR+成像

　　在SPR技術基礎上，近年來又衍生了SPRi表面等離子共振成像技術，成像為用戶帶來了兩個頗有意義的功能：實現了整個工作區域的可視化以及高通量平行實驗。SPRi可進行多重分析，不同類型的配體可以固定在單個 SPRi-Biochip 生物芯片上。可以同時研究多個參數（濃度、固定 pH 值等），方便對分子進行比較、排序和選擇。此外，也有將SPR和光學顯微鏡結合的技術，可體外測量單個細胞在其天然環境中的結合反應和動力學。

基于Kretschmann構型的SPRi示意

　　在SPRi中，準直光束通過棱鏡照向整個功能化的金表面，覆蓋所有點樣點。在芯片上反射后，光束被探測器的成像傳感器（二維陣列）獲取，每個像素對應于 SPRi-Biochip 生物芯片上的給定位置。動力學測量包括同時監測多達幾百個樣點的反射率隨時間的變化。傳統的 SPR 系統可并行監控少量的相互作用。成像系統由于采用了一種特殊的流通池，能夠并行監測多達數百個相互作用。此外，與其他技術（如質譜）的耦合在通道系統中非常復雜，而SPRi-MS的連接非常直接、效率更高。

　　MP-SPR多參數表面等離子共振

　　MP-SPR與傳統SPR最大的區別在于光學方面，傳統的SPR的光學測量僅僅集中于非常窄的θ角范圍內，而MP-SPR能夠掃描很寬的θ角范圍(幾十度)。通過掃描一系列角度，提供完整的SPR曲線和多個參數，并提取多個感應圖譜；而且，一次完整掃描可包括兩種環境：氣體和液體。

生物膜干涉技術BLI

　　2001年作出原型機后，華人科學家譚洪在美國硅谷創辦了Fortebio公司，2005年推出首款基于生物膜干涉技術（Biolayer Interferometry）的分子互作產品Octet QK，2011年Fortebio被美國Pall公司收購，2015年Pall被丹納赫收購，由于反壟斷的要求，2020年后該產品隸屬賽多利斯。2020年底，BLI技術被正式收錄于《美國2021版藥典》1108章。

　　BLI通過檢測干涉光譜的位移變化來測定分子互作。其工作原理是：一束可見光在傳感器末端的光學膜層的上下界面會形成兩束反射光譜，并形成一束干涉光譜。分子結合后膜厚增加，干涉光譜右移，記錄波長的位移值（Δλ）為Y軸，橫軸是時間，可以實時檢測結合的情況，分析物的濃度和斜率正相關。當然，解離時波長位移值會下降。BLI的優點是：對任何未結合的分子，周圍介質折光率的變化或流速的變化均不會影響干涉圖譜，因此可直接對粗樣品進行分子互作分析；缺點是：無法有效檢測到小分子的相互作用。更多原理視頻

BLI檢測原理示意圖

微量熱泳動技術MST

　　許多領域都是10年一種新技術，分子互作也不例外。既然主要的測定參數是平衡解離常數Kd值，再設計一種原理來獲取Kd值也可以。2010年，NanoTemper推出了第一款基于微量熱泳動技術的分子互作儀Monolith NT.115。

　　微量熱泳動技術（MST）源于一種物理現象：溶液中的分子會在溫度梯度場中定向移動。1856年，Carl Ludwig和Charles Soret最初發現該現象。Stefan Duhr 和Philipp Baaske在慕尼黑大學攻讀博士期間闡明了熱泳動的理論基礎，獲得兩項ZL并于2008年創辦了NanoTemper公司。

　　MST基于熒光信號來檢測分子互作。MTS的基本原理是：互作的一個Target分子帶上熒光基團，另一個作為配體Ligand。樣品裝在毛細管中，上方包含熒光的激發檢測單元LED以及精準加熱樣品的紅外激光器。實驗開始采集MST曲線，一開始有初始熒光，打開紅外激光加熱20秒，可檢測到衰減的熒光曲線。熒光信號衰減首先來源于熒光分子發生了熱泳動（Thermophoresis），即加熱后分子朝著遠離熱源的方向發生泳動，泳動的范圍取決于分子的整體性質，包括大小、電荷及水化層；其次熒光強度有溫度依賴性（TRIC），通常隨溫度升高衰減。當熒光分子結合配體后，會間接地通過改變構象來影響熒光分子的化學微環境，從而導致熒光信號衰減的速率發生改變，衰減曲線會發生上移或下移。

MST檢測原理示意圖

　　這種改變依賴于配體的濃度，在MST實驗中，可將配體比例稀釋成16個濃度，在曲線上選取一個時間點如5秒，以配體濃度為橫坐標，以熒光強度為縱坐標作圖，將得到16個點，擬合出一條S形結合曲線，從而得到解離常數Kd值，Kd代表當一半的Target被結合時，所需要的Ligand濃度，Kd值越小，親和力越強。

　　MST技術不需要固定樣品，樣品在溶液中檢測，只需要將Target分子標記上熒光基團，不受 buffer限制，幾乎覆蓋全部類型的分子，具有靈敏度高，簡便、快速、樣品消耗少等特點。更多原理視頻

光譜位移技術

　　2022年，NanoTemper又推出基于光譜位移技術的Dianthus和結合兩種技術的Monolith X。光譜位移技術也基于熒光信號變化。熒光標記的樣品有特定的發射光譜，配體結合后導致微弱的發射光譜位移（藍移或紅移亞nm范圍）。實驗時仍將配體進行比例稀釋，加入恒定濃度的熒光分子，在用590nm的光激發樣品后，儀器會同時監測雙波長（650nm和670nm）下配體結合引起的光譜位移，將兩種波長下的熒光強度比值與對數的配體濃度作圖，可擬合得到平衡解離常數Kd。光譜位移技術檢測速度非常快，只需1分鐘即可完成Kd檢測。更多原理視頻。

光譜位移技術檢測原理示意圖

光柵耦合干涉技術GCI

　　2015年，瑞士Creoptix公司（現隸屬馬爾文）推出基于光柵耦合干涉技術（Grating-Coupled Interferometry，GCI）的實時分子互作儀器WAVE。一束激光光源通過光柵將光耦合在波導傳輸結構中，對應一束參比光從相位調制器（Phase Modulator）進入另一個光柵和其耦合，因此會形成相位差和干涉花紋。當結合分子后，會改變芯片表面的折光率變化，而導致檢測光的相位發生變化。

　　相比傳統SPR，GCI利用了波導技術，消逝場對樣品的穿透深度更小，僅在芯片表面與樣品溶液接觸，并延長了其與樣品相互作用的長度，如從100nm延申光路長度到2mm，因此靈敏度更高（< 0.015 pg/mm2），分析物的分子量無下限。此外，WAVE的流路中，所有閥路遠離芯片并無需氣閥，因此不易堵塞，對粗樣品更友好。在動力學測定中，除了傳統方法，還可以用waveRAPID方法，無需稀釋多個梯度，只從單孔進樣，采用持續時間增加的重復脈沖進樣（RAPID），也可擬合出動力學曲線，比傳統動力學檢測約快10倍，可改進基于片段的小分子篩選和動力學分析，加速藥物開發的過程。

　　此外，Creoptix GCI 讀數方案的優勢在于干涉圖是在時域和波導管內生成，而不是投射到 CCD 攝像機上。因此，與經典的波導干涉儀或SPR相比，將傳感器表面的折射率變化作為與時間相關的相移信號進行測量可提供更可靠的讀數，而不受溫度漂移或振動的影響，從而在信號和時間上實現出色的分辨率。更多原理視頻。

光柵耦合干涉技術GCI

等溫滴定量熱技術ITC

　　ITC也是一種量化研究生物分子相互作用的無標記技術，可直接測量生物分子結合過程中釋放或吸收的熱量。實驗時，保持儀器樣品池和參比池溫度相同，通過加熱補償原理檢測體系熱量變化，從而得到生物分子的結合信息。

　　ITC檢測方式與化學反應中的酸堿滴定法相似，可以測定結合配偶體在自然狀態下的親和力。實驗過程中，配體（如受體、抗體）分子在恒溫條件下滴定到相互作用分子的溶液中，結合釋放的熱（H）被實時記錄下來。連續進行多次滴定，分子結合釋放或吸收的熱直接正比于結合的分子數量，當系統達到飽和時，只能觀察到稀釋熱。將每次滴定產生的熱效應與滴定和被滴定分子的摩爾比作圖，可以得到一條結合曲線。ITC能自動完成滴定、數據采集和分析，使整個實驗過程非常簡單。主要代表產品為2015年馬爾文推出的手動 MicroCal PEAQ-ITC系統與新型全自動MicroCal PEAQ-ITC 系統。

ITC檢測原理示意圖

　　ITC技術具有快速、準確、樣品用量小、對反應體系的要求不高（如對體系的透光度、渾濁度、粘滯度要求不高）等優勢，被廣泛應用于生物及醫藥等相關領域。商業化等溫滴定量熱儀最早出現在上世紀80年代后期，在過去的近30年中，ITC技術成為研究分子相互作用的常用方法之一。隨著科學技術的發展，等溫滴定量熱儀將會更加靈敏、快速、易用。

分子互作儀的市場分析及預測

　　分子互作分析儀是生命科學研究、新藥研發的核心工具，是生物制藥、CRO、CDMO、科研機構的標配設備。

　　據Insight Partners，全球分子互作檢測市場規模預計將從2021年的4.7482億美元增長到2028年的8.2971億美元，年復合年增長率（CAGR）為8.3%。分子互作耗材在2021年占據了很大的市場份額，預計在2021-2028年期間將達到8.6%的最高復合年增長率。根據MMR，2021年分子互作檢測市場的價值為6.2445億美元，預計到2029年將達到11.356億美元，預測期間（2022-2029年）的CAGR為7.76%。而Data Bridge市場研究機構預測更為樂觀，到2028年分子互作檢測市場將達到19.6億美元。但無論哪種預測，共同點都看好未來分子互作儀器市場。

　　據蛋殼研究院估算，2020 年中國分子相互作用儀市場容量約 27.6 億元，2022年的市場規模將達8億元。

分子互作儀檢測市場：競爭格局和主要發展

　　創新是企業致勝的法寶，近年來，各分子互作儀生產企業在研發上投入大量資金，不斷將新的檢測技術和產品引入市場。對生物技術和新藥發現的高投資是推動亞太地區分子互作產品市場增長的主要因素。各國政府機構起草并頒布實施與制藥行業有關的國家法律、法規、政策和標準。

　　思拓凡（Cytiva）、賽多利斯（Sartorius），諾坦普（NanoTemper）、馬爾文帕納科（Malvern PANalytical）、伯樂（Bio-rad）、布魯克（Bruker）、堀場（HORIBA）、懷雅特（被Waters收購）、量準（Xlement）等是在分子互作市場運營的主要公司。廠商都在積極采取多種戰略增加競爭力，比如推出不斷新產品實現產品多樣化、擴大市場占有率，以及獲得新的客戶群來挖掘更多的商業機會。

　　2021年，技術進步、政府大量資金投入、藥物研究項目的加速發展，推動亞太地區在分子互作全球市場中占有最大份額。中國的制藥行業已經從關注仿制藥轉向創新療法。2021年，中國的在藥物研發上投入首次超過了美國，而且，中國在研發支出中所占的份額進一步增加。據預測，北美地區分子互作在2021-2028年有最高的年復合增長率，該增長源于社會對分子水平研究的支持、藥物研究項目的極大增加及現有檢測方法具有更高靈敏度等因素。例如，美國化學學會（ACS）和毒理學學會（SoT）均是支持非標記技術研究的組織。

　　分子互作檢測產品的市場分為儀器和耗材。未來，消耗品細分市場可能會占據最大的市場份額，并以最高的復合年增長率增長。

　　從技術角度，分子互作檢測市場分為表面等離子體共振SPR，生物層干涉測量BLI，光柵耦合干涉技術GCI、等溫滴定量熱ITC、微量熱泳動技術MST等。按照MMR 2021年總結，SPR占據最大的市場份額，達到20%，并在預測期內具有最高的復合年增長率，SPR一個重要的應用市場是高通量藥物篩選（HTS）。

　　分析測試百科網整理了近兩年多（2021年1月~2023年4月）分子互作分析儀中標信息，涉及金額超2.8億多元。此外，本次中標統計主要匯總了高校、科研院所和醫院等政府采購平臺發布的信息，本網特對中標信息進行分析形成相關統計圖（見圖9），以饗讀者。根據統計分析，美國Cytiva和德國Sartorius兩家品牌仍占據大部分市場份額，占比分別為33.11%和27.15%。排名第三的德國NanoTemper這幾年發展迅猛，憑借可靠的技術和產品獲得了19.86%的市場占有率。國產品牌Gator和北京英柏生物也分別占有一席之地，打破了之前國產品牌空白的窘境。此外，Malvern、Reichert、Nicoya、Biosensing Instrument等品牌也有一定市場份額。不過，該圖表尚不能反映研發型藥企和CRO企業的采購情況。

分子互作儀主要品牌國內市場占有情況

　　按照市場應用，分子互作檢測市場分為結合動力學，結合熱力學，內源性受體檢測，活性物確定，生成先導物和其它應用。目前，結合動力學應用占據最大的市場份額，并在2022~2028年間有最高的復合年增長率。導致該細分市場增長的因素是，制藥業對分子互作的需求不斷增長，結構生物學的進步，使用分子互作檢測新冠病毒的研究性工作不斷增長。

　　基于最終用戶，分子互作檢測市場分為制藥公司和生物技術公司、醫院、高校和研究機構。到2022年，制藥和生物技術公司占據最大的市場份額，并在2022~2028年間有最高的復合年增長率。過去的2022年，由2000億貼息貸款專項引爆了國內的儀器的采購市場，其中分子互作儀在10-12月中標數量達到了全年高位水平，高于前九個月之和。

　　亞洲經濟體（以中國和印度為主）的增長，以及對生物技術和藥物研發資金投入的增加，是推動亞洲非標記檢測市場的主要因素。亞洲國家擁有生物技術產業眾多的科學人才，地區的產業合并、合作和伙伴關系數量亦在增加。例如，2018年7月，Ferring制藥（瑞士）在印度Hyderabad建立基因組谷（Genome Valley）研發實驗室和制造工廠。

　　欲知分子互作江湖上的各門派代表團隊和其新產品，且聽下回分解......