樣品分子與固定相之間不存在相互作用，色譜固定相是多孔性凝膠，僅允許直徑小于孔徑的組分進入，這些孔對于溶劑分子來說是相當大的，以致溶劑分子可以自由的擴散出入。
樣品中的大分子不能進入凝膠孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先從柱中被流動相洗脫出來；中等大小的分子能進入凝膠中一些適當的孔洞中，但不能進入更小的微孔，在柱中受到滯留，較慢地從色譜柱洗脫出來；
小分子可進入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強的滯留，會更慢的被洗脫出；溶解樣品的溶劑分子，其分子量最小，可進入凝膠的所有孔洞，最后從柱中流出，從而實現具有不同分子大小樣品的完全分離。