分離核仁實驗—從人肝臟或胎盤組織中分離核仁

組織

NKM

粗孔濾紙Teflon-玻璃勻漿器

1. 準備溶液：

NKM：0.13 mol/L NaCl，5 mmol/L KCl，8 mmol/L 乙酸鎂

2.2 mol/L 蔗糖，10 mmol/L MgCl₂

0.88 mol/L 蔗糖

0.34 mol/L 蔗糖，含 0.5 mmol/L MgCl₂ 或 0.5 mmol/L 乙酸鎂

2. 用大約 200 g 組織，切成小塊（2~4 cm² ) 通過一攪肉機。

3. 用 NKM 懸浮攪碎的組織；最終體積大約為 850~900 ml。在一 500 ml 的離心管中 4500 g 離心 10 分鐘。用 NKM 溶液洗兩次。

4. 稱取洗過的沉淀的重量，懸浮于 100 ml 含 2.2 mol/L 蔗糖，10 mmol/L MgCl₂ 或乙酸鎂的溶液中。用帶緊密結合 Teflon 研棒，馬達推動的 Potter-Elvehjem 勻漿器勻漿 10~12 次。

5. 將勻漿用含 Mg²⁺ 的 2.2 mol/L 蔗糖溶液稀釋至肝臟沉淀重量的 10 倍。

6. 先后用一層和兩層粗孔濾紙過濾勻漿。

7. 過濾后的勻漿 20000 g 離心 2 小時。

8. 用一干凈的刮刀刮下沉淀。用一緊密結合 Tefflon-玻璃勻漿器勻漿使之溶于含 5 mmol/L Mg2+ 的 0.88 mol/L 蔗糖溶液中。2500 g 離心 20 分鐘。

9. 從細胞核沉淀中分離細胞核或核仁。

(1) 分離細胞核

① 沉淀重懸浮于含 5 mmoI/L Mg²⁺ 的 0.34 mol/L 蔗糖溶液中。

② 下面加一層 0.88 mol/L 蔗糖溶液（無 Mg²⁺）。

③ 2500 g 離心 20 分鐘。

(2) 制備核仁

① 將第 8 步中得到的沉淀以每克組織 0.3 ml 的體積重懸浮于含 5 mmol/L Mg²⁺ 的 0.34 mol/L 蔗糖溶液中。

② 用一冰水冷卻的菊花狀振蕩頭進行超聲處理。

③ 每 10 秒鐘超聲處理后進行 10 到 20 秒的冷卻間隔，監測細胞核的破碎情況。

10. 超聲處理物從振蕩頭中取出放進一 50 ml 的塑料離心管中。

11. 75 g 離心 4 分鐘澄清超聲處理物。

12. 取出上清放到干凈的離心管中。

13. 下面加一層無 Mg²⁺ 的 0.88 mol/L 蔗糖溶液，2500 g 離心 20 分鐘。

14. 吸出上清。