分離的細胞核的染色質的微球菌核酸酶消化實驗

動物組織 ［如肝、腎和（或）脾］

核緩沖液 A、B、C無 Ca 和 Mg 離子（CMF） 的 PBSNaOH2×TNESK 溶液CaCl2微球菌核酸酶（MNase） 儲液

剃刀刀片或解剖刀培養皿帶有聚四氟乙烯包被的磨棒的組織勻漿器電動組織磨碎機相差顯微鏡輕薄棉布玻璃離心管（如 Corex）帶有定角轉子的冷凍高速離心機超速離心機和超凈管紫外分光光度

1. 處死動物或獲得活體解剖后，將分離的組織放在置于冰上的 100 ml 燒杯中，馬上用 25 ml 核緩沖液 A 沖洗。

2. 將組織轉移到 100 mm 塑料培養皿中，置冰上，按以下量加入核緩沖液 A： 肝，8 ml；腎，5 ml； 脾，4 ml。將組織用剃刀刀片或解剖刀切割成大小為幾毫米的小塊。

3. 將每個小塊移入不同的勻漿器。對于上述大小的組織，如果是肝或腎組織，用 15 ml 的勻漿器；如果是脾組織，用 10 ml 勻漿器。處理脾組織時，在冰上放置 10 min 之后再轉移，以使血紅細胞留在上清中。處理肝或腎組織時，可以馬上丟棄上清。

4. 在所有的樣本中加入 5 ml 新鮮的核緩沖液 A。混合，再次移去上清，然后再加入 5 ml 新鮮的核緩沖液 A 重懸組織塊。

重要提示：從這一步開始，在冷室中進行所有操作。

5. 使用電動組織磨碎機勻漿組織 5～10 次，再手動勻漿 5 次。取少量勻槳混合物加入到 CMF PBS 中，在相差顯微鏡下觀察。觀察到的核是灰色的、很圓的小泡。如果仍然有完整的組織或細胞，再進行大約 5 次勻漿，再次觀察細胞破碎的量。

6. 將輕薄棉布折疊成 8 層，在核緩沖液 A 中事先浸濕，過濾勻漿混合液到置于冰上的 30 ml Corex 管中。戴好手套，擰絞棉布使液體流盡。

7. 在 15 ml Corex 管中加入 1：1 核緩沖液 A/核緩沖液 B 作為緩沖層。用以下量的緩沖液 A＋B 混合液：肝，1.4 ml；背，1ml；脾，0.6 ml。將勻漿混合液加在緩沖層上。

8. 使用定角轉子，40℃， 12 000 g （如 55-34 號轉子 10 000 r/min） 離心 15 min。

9. 去上清，沉淀使用如下體積的核緩沖液 B 重懸：肝和腎，11ml； 脾，3.6 ml。先加入 2 ml 核緩沖液 B 輕柔地重懸沉淀成為黏稠的液體，再加入剩余的核緩沖液 B。

10. 在 1/2 in× 2 in的超凈 SW50.1 離心管中加入 1.2 ml 核緩沖液 B 作為緩沖層，將重懸液各取 3.6 ml 加在其上（肝和腎分為 3 管，脾為 1 管）。

11. 4℃， 120 000 g （如 SW50.1 轉子 37 000 r/min） 離心 90 min。

12. 倒掉上清，將離心管倒置在吸水紙上以去凈余液。輕柔地將沉淀重懸于如下體積的核緩沖液 C 中：肝和腎，0.2 ml； 脾：0.25 ml。將同一組織來源的重懸液合并到一個管中，置冰上。

13. 取 5 ul 每種核重懸液加入到 2 ml 的 1 mol/L NaOH 中，用分光光度計測定 OD₂₆₀。 用核緩沖液 C 稀釋核重懸液至測得的 OD₂₆₀ 值為：肝 0.25； 腎和脾 0.085。

14. 每種核重懸液各取 1/5 與等體積的 2×TNESK 溶液混合。充分混合后，37℃ 溫育過夜。

15. 將剩余的液體在冰上分到以下數目的反應管中：肝和腎，大于 6 個；脾，大約 3個。要經常搖動樣品以防止結塊。

16. 在第一個管中加入 0.1 mol/L CaCl₂ 至終濃度為 3 mmol/L， 37℃ 溫育 3 min， 然后加入等體積的 2×TNESK 溶液，37℃ 溫育過夜。

17. 在第二個管中加入 0.1 mol/L CaCl₂ 至終濃度為 3 mmol/L， 37℃ 溫育1.5 min 加熱核。

18. 在各管中分別加入所需量的 MNase。MNase 的部分消化，可以按如下的量進行嘗試：肝和腎，0.1 U MNase/ml 反應液，0.2 U/ml、0.5 U/ml、1 U/ml、2 U/ml； 脾，0.5 U/ml 和 1 U/ml。MNase 的完全消化，嘗試 10～100 U/ml。混勻，37℃ 溫育 1.5 min。

19. 加入等體積的 2×TNESK 溶液終止反應，劇烈搖動管子幾次混勻，37℃ 溫育過夜。

20. 對每一個所使用的 MNase 濃度，重復步驟 17～19。

21. 純化和鑒定 DNA。

所有溶液、反應管、吸量管、吸頭都必須為冰冷的。