分離肽和蛋白質色譜柱的維護

1、使用常規要求

pH：為了保證色譜柱長壽命，硅膠基質色譜柱的使用pH范圍是2～7，超出此范圍的色譜柱壽命與功能團結構有關，但是偏離2～7范圍越遠，色譜柱性能下降的越快。

溫度：典型硅膠基質色譜柱的使用溫度在5℃與60℃之間，高溫使用會縮短柱壽命。

緩沖溶液：生物樣品分離通常要求使用緩沖溶液控制流動相的pH值，仔細控制避免緩沖溶液與流動相有機溶劑混合時產生沉淀，色譜柱和HPLC系統不能儲存在含鹽或緩沖溶液的體系中。

壓力：操作壓力升高，色譜柱壽命縮短，通常要求色譜柱使用中壓力低于3000psi。壓力與流動相流速和柱長成正比，與粒徑平方成反比。

相同規格的3μm填料色譜柱壓力約為5μm色譜柱的兩倍。流動相不同壓力也會有明顯差異，如60/40的甲醇/水大約是60/40甲醇/水的兩倍。隨色譜柱使用，壓力會緩慢增加，色譜柱壓力突然增加可能是色譜柱或連接管堵塞。

2、色譜柱的維護

使用在線過濾器和保護柱能夠有效避免微粒和雜質在色譜柱頭的聚集，增加色譜柱壽命，  在進樣閥和色譜柱之間依次安裝在線過濾器和保護柱的效果最好。

過濾：進樣閥和色譜柱之間的在線過濾器能夠有效阻止來自流動相、泵密封圈和樣品的微粒。在線過濾器篩板的孔徑小于色譜柱入口篩板孔徑時效果最好。在線過濾器常用孔徑為0.5μm，系統壓力升高時需要更換在線過濾器。

保護柱：保護柱實際上通常是比較短的分析柱，通過吸附可能污染分析柱的強保留雜質達保護色譜柱的目的。保護柱的篩板與在線過濾器一樣可以阻擋微粒雜質。為了達到最好的保護效果同時避免導致色譜的改變，最好選用與分析柱相同或相似的填料填充保護柱（如C18分析柱用C18保護柱）。

保護柱不要選用保留太強的填料，以免使保留整體增加。為了降低保護柱對分離的貢獻，可以用比分析柱填料保留弱的填料填充，如用150? C18分析柱時，可以選用比表面積較小的300? 大孔C18填充保護柱。分離明顯變差或反壓明顯升高時需要更換保護柱。

3、色譜柱的清洗

如果樣品中部分組分沒有被流動相洗脫，它們就會逐漸在色譜柱中聚集，最后導致色譜柱性能變差，為了保證色譜柱重復性、延長使用壽命，應該周期性地對色譜柱進行清洗而不能夠任其自然。如果色譜柱設計中可以反向使用，反壓太高時，用低流速反向沖洗不會對填充良好的硅膠柱床造成損害，反向沖洗時不要接檢測器。

反向沖洗一般使用常用流速的1/2，用強洗脫溶劑沖洗10～20 色譜柱體積。反相色譜一般使用極性有機溶劑如異丙醇含量較高的溶劑沖洗。用幾次循環從弱到強的梯度有時比用強洗脫能力流動相等度沖洗效果更好，對疏水性蛋白質吸附的反相色譜柱非常明顯。

如果上述過程清洗色譜柱的效果不夠理想， 可以用非極性有機溶劑或低濃度表面活性劑清洗，二氯甲烷或氯仿對強疏水性或油性化合物的效果較好，表面活性劑如0.5%SDS可以有效清除沉淀的蛋白質，改性劑，如5～8M的脲或鹽酸胍可以有限去除強吸附蛋白質。

另外，用明顯高或低于使用流動相pH值的稀緩沖溶液對部分不溶性沉淀有較好的作用。最有效地清洗方法還取決于色譜柱和樣品的具體情況。

上述過程的主要目的是去除在使用流動相條件下不能洗脫的化合物， 另一個目的是對由于流動相或部分化合物引起緩慢變性的色譜柱進行更新。用有機溶劑沖洗色譜柱之前，應該首先用水含量較高的混合溶液（如90/10 H2O/ACN）將緩沖溶液和添加劑置換沖洗，不要用純水。升高溫度能夠改進清洗效果。

色譜柱頭的燒結篩板用于固定色譜柱床填料，只有在準備修補色譜柱時才能打開，建議在打開之前與儀器公司技術人員聯系。

4、色譜柱的儲存

乙腈和水的混合溶劑是儲存反相色譜柱的理想溶劑，其中乙腈含量應不低于10%，避免在TFA等酸性條件下儲存色譜柱，緩沖溶液和添加劑應該從系統中沖洗干凈，以免由于溶劑揮發造成沉積，理想的儲存溶劑應該抑制微生物的生長并不能導致固定相的水解，因此不能在純水條件下儲存色譜柱。

儲存溶劑最好能夠與使用流動相互溶，10%乙腈儲存色譜柱可以直接用幾乎所有的分析流動相平衡，不會引起鹽沉淀。

雖然沒有確切的色譜柱干燥儲存對性能影響的證據，但為防止溶劑揮發，不銹鋼堵頭比塑料堵頭更好。用醇/水混合溶劑清洗和儲存色譜柱時，注意由于粘度較大，避免導致壓力太高。