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下面的實驗流程詳細描述用 CSR 在 E.coli 中對 Taq
聚合酶突變體的篩選。這個方法保證在標準的 PCR 反應條件下，聚合酶突變體是有活性的。用來產生文庫的方法是核苷酸類似物 [27] 和易錯
PCR [28]，這里不再描述。引物 1 ( 5'-C A G G A A A C A G C T A T G A C A A A A A T C
T A G A T A AC G AG G G C AA-3' ) 針對表達載體 pASK75 [29] 是特異的，用 XbaI 和
SalⅠ將 Taq 基因連接到載體 pASK75。引物 2（5'- G TA A A A CGA CGG CCA GTA CC AC
CG AAC TG CG GG TG ACG CC AAGC-3' ) 針對表達載體 PASK75 是特異的。每個引物含有 5'
的突起黏末端，這樣可以用引物 3 ( 5'-C AG G AAAC AG C TATG AC-3' ) 和 4 ( 5'-GTA A A
A CGA CGG CCA GT-3' ) 來加強 CSR 的篩選。
3.1 用 Tet 啟動子在細菌中表達 Taq 聚合酶
( 1 ) 挑取單克隆到 2 ml 的 2X TY [ 見 14.2 ( 2 ) ] 培養基中，并加入 0.1 mg/ml Amp，在 37°C 過夜培養。
( 2 ) 將上述培養液以 1: 100 的比例加入到新鮮的 2X TYA 37°C 培養，直到菌液 OD600 達到 0.6~0.9 ( 培養應不超過 2~3 h)。
( 3 ) 加入 ACROS ( 非毒性四環素衍生物），終濃度為 0.2 μg/ml 到步驟（2 ) 培養液中，誘導 pASK75 種的 Tet 啟動子，表達蛋白質。
( 4 ) 在 37°C 持續搖菌 2~4 h。
3.2 收集表達了聚合酶的細胞
( 1 ) 在離心機中 [ 1300 rcf ( 3000 r/min)，15 min ] 離心細胞，去掉上清液，用與培養基相同體積的 1 X Tag 緩沖液輕輕地懸浮細胞。
( 2 ) 重復離心收集細胞和重懸細胞，這次重懸細胞使用 1/10 培養基體積的 1X Taq 緩沖液。
( 3 ) 檢測 OD600 的吸收值，確定細胞的個數（OD600 = 1 相當于 8 X 108 個細胞/ml)。
3.3 建立 CSR
(
1 ) 將水相的 CSR 在冰上加入到 1X Tag 緩沖液，加入 1 μmol/L 引物 1 和 2、0.25 mmol/L dNTP、50
μmol/L TMAC ( 可選；見注 1 )、0.05% ( V/V )
不含脫氧核糖核酸酶的胰腺核糖核酸酶（可選）和誘導表達的細胞（終濃度為 1X109 個細胞/ml)。
( 2 )
準備油相 CSR，混合輕礦物油、4.5%（V/V）Span 80、0.4% ( V/V ) Tween-80、0.05% ( V/V )
Triton X-100，在室溫下持續攪拌。由于表面劑的高黏性，需要準備一個大體積油相 CSR ( 大于 50 ml)
，并且用切斷吸管尖去掉表面活性物質。油相的 CSR —旦準備好，可以在黑暗的室溫中存放 1 個月。
( 3 ) 將 200 μl 的水相 CSR 加入到 400 μl 油相 CSR，加入過程中要用點滴的方法 ( 每滴 5~10 μl，間隔 5s)，整個過程在 2 ml 的平底管中進行，需要用磁力攪拌器 ( 1000 r/min) 不停地攪拌。
( 4 ) 加入最后 1 滴后，持續攪拌 5 min。最后需要乳化成白色的并且有黏性的狀態 ( 見注2 )。
3.4 CSR
( 1 ) 轉移乳化液到 0.5 ml 薄壁 PCR 管（100 μl/管），然后加入 2 滴礦物油，防止揮發（見注 3) 。
( 2 ) 進行 PCR 反應，94°C 5 min，裂解細胞，破壞其他酶的活性，然后進行如下 20 個循環：94°C ( 1 min ) ，60°C ( 1 min ) ，72°C ( 5 min)。
PCR 完畢后，乳化相應該仍是白色的，上面覆蓋了一層油相。體積可能會減少，但不表明乳化的隔室發生合并。乳化相的聚合或破碎直接表現為白色的乳化相之下有個明顯的水相層。這時候就表明有很多因素干擾了乳化相的穩定，如各種成分混合的不充分。
3.5 實施
( 1 ) 用 2 倍體積（200 μl ) 的二乙醚，來分離水相的 CSR。漩渦振蕩混合物 20s，然后在 20000 rcf ( 13000 r/min) 離心 2 min。
( 2 ) 出現兩個液體層。小心地移動有機相下面的水相層，然后轉移到一個新的 1.5 ml EP 管中。
CSR 的反應可以通過兩種不同的方法來實施。
3.5.1 PEG 抽提方法
( 1 ) 用苯酸 -氯仿（1/1，V/V ) 來萃取液相層，然后接著用氯仿-異戊醇（24/1，V/V）來萃取。
( 2 ) 在液相層，加入 0.5 個體積的 PEG800/MgCl2 溶液 [ 見 14.2 ( 13 ) ]，然后用吸量管上下反復混勻幾次。
( 3 ) 室溫，20000 rcf (13000 r/min) 離心 10 min。去掉上清液（含有剩余的引物和 dNTP），沉淀用 TE 重懸[ 見 14.2(14)]。
( 4 ) 遺留的聚合酶，在加入 20~50 U DpnI 到液相層中，37°C 放置 1 h 后，其量可減少（見注 4)。
(
5 ) 為了確保完全去除引物，進一步利用 PCR 純化試劑盒（Qiagen) ，純化液相層中的 CSR 產物。用 35% ( V/V )
鹽酸胍洗 2 次，保證完全去除殘留的引物。最后將純化的產物加到 50 μl 的緩沖液 EB 中 [ Qiagen；見 14.2 (16)]。
3.5.2 快速實施
( 1 ) 利用 14.3.5.1 步驟（5 ) 中的方法，用 PCR 純化試劑盒純化 CSR 產物。用 35% ( V/V ) 鹽酸胍洗 2 次，保證完全去除殘留引物。最后將純化的產物加到 50 μl 的緩沖液 EB 中。
( 2 ) 取 7 μl 的產物，加入 1 μl 的 10 X Taq 緩沖液、1 μl 的 20 U/μl DpnI 以及 1 μl ExoSAP，然后在 37°C 放置 1 h，接著在 85°C 放置 15 min。
3.6 提取
(
1 ) 使用外側巢式引物 3 和 4，2 次擴增需要篩選的基因。20% 的需要篩選的產物被加入 50 μl 的 PCR 反應液中（即 10
μl 的純化產物加入到 50 μl 溶液中）。但是，這個用量有可能增多或減少，需要根據第一次的結果（見注），2
次擴增的反應條件需要根據第一次擴增的結果來調整，常用的是 25 個循環：94°C (30s)、50°C(30s )、72°C ( 5
min)。循環的次數也可以根據結果來調整（見注）。
( 2 ) 結果用瓊脂糖凝膠來檢測。成功的篩選是出現一條正確大小的條帶（對于聚合酶，是 2.5 kb) ，而在負對照中不應出現條帶 [ 見注 5 和注 6 ]。
CSR
的條帶可進一步切膠純化，再次酶切，重新克隆到載體 pASK75 上。然后轉化到 TG1 [ 見 14.2 ( 1 ) ]，轉化的產物或者按
14.3.7 所描述的方法篩選，或者按 14.3.2~14.3.6 中所描述的方法培養、誘導，為下一輪的選擇做準備。
3.7 Taq 聚合酶的快速篩選
( 1 ) 為了篩選突變體，轉化的克隆在 TYE-Amp 平板上擴增 [ 見 14.2 (3)]，然后接種到 96 孔板上，每孔含有 100 μl 的 2X TYA [ 見 14.2( 2 ) ] 。
( 2 ) 上述 96 孔板培養 6~10 h 以后，即加入 20 μl 含有 1.2 μg/ml ACROS 的 2X TYA，繼續培養 2~4 h，表達蛋白質。
( 3 ) 用排槍，從 96 孔的每個孔轉移 2 μl 誘導的細胞到 30 μl 的 PCR 混合物中（見 14.3.3 和 14.3.4 ) ，該混合物也在一個 96 孔的 PCR 平板上。
( 4 ) 在 96 孔 PCR 平板中，每孔加入覆蓋油，然后進行 PCR 反應 [ 見 14.3. 4 (2)]，可以將循環增加到 30 次，用來篩選活性比較弱的突變體。用野生型的作為對照很重要。陽性鑒定可在瓊脂糖凝膠上進行。
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