劉虎威、白玉發文：脂質組學分析中樣品前處理研究進展

　　近日，《色譜》期刊責任副主編劉虎威、青年編委白玉等人發文：脂質組學分析中樣品前處理技術的研究進展。

脂質組學分析中樣品前處理技術的研究進展

　　作為代謝物的一大類重要組成部分, 脂質在生命體中扮演著重要作用, 如磷脂雙分子層是構成細胞膜的基本骨架, 可維持細胞的完整性和相對獨立性； 脂肪酸和甘油三酯是多種細胞的能量來源, 維持細胞的基本活動與功能； 許多脂質分子如類花生酸、溶血磷脂、內源性大麻素等可作為二級信號傳遞分子, 參與細胞信號傳導等。脂質組學作為代謝組學的一個重要分支, 是對脂質及其相關結構與功能進行研究的科學, 其定義為“對脂質分子種屬及其在生物學上的作用, 涵蓋脂類代謝、功能蛋白質表達以及基因調控等因素的全面描述”。

　　目前, 質譜(MS)已成為脂質組學研究中最有效的技術手段之一。基于MS的分析方法主要可分為3種：利用MS直接進樣檢測的“鳥槍法”, 與其他分離技術如液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、毛細管電泳(CE)等結合的聯用方法, 以及可實現樣品空間分布的質譜成像(MSI)方法。脂質組學研究對象通常是基質復雜的生物樣品, 如血清、血漿、尿液、組織等, 除MSI方法外, 在進行分析前往往需要對樣品進行富集和提取。提取后的脂質在MS檢測時可能仍會面臨靈敏度低等問題, 這就需要對樣品做進一步處理, 化學衍生化是解決該類問題的有效手段之一。本文針對脂質組學分析中的樣品前處理技術, 以脂質化合物提取方法與衍生化技術為重點進行了評述, 并對其發展趨勢進行了展望。

1脂質的提取與富集技術

　　通常生物樣本采集后直接利用液氮快速冷凍, 之后放入低溫(如-80 ℃)環境儲存, 從而盡量減少樣品中各類物質發生改變。在進行分析前, 液體樣品在4 ℃條件下復溶, 然后進行充分混合； 固體樣品則可借助研缽或勻漿機, 通過加入適當溶劑完成混合。

　　常用的脂質提取技術主要包括液液萃取(LLE)與固相萃取(SPE)兩種方式。由于LLE可提取出較為全面的脂質分子, 適用于非靶向全脂分析； SPE過程使樣品經過分離和富集步驟, 進一步除去干擾物質, 提高被分析物的濃度, 更適用于某一類或某幾類脂質分子的靶向代謝組學分析。

　　1.1 液液萃取

　　生物樣品中蛋白質的存在會影響脂質分析方法的精確度與準確性, 如不提前去除, 可能縮短儀器的使用壽命。為了減少樣品損失, 前處理步驟應盡可能少, 相對簡單的操作是將蛋白質沉淀與脂質提取一步完成。

　　LLE是脂質組學中使用最廣泛的萃取方法。與單相溶劑萃取體系不同, LLE利用被分析物在兩種互不相溶的溶劑中分配系數的差異實現不同物質的分離。脂質組學分析中應用最多的LLE方法有3種：Folch法、Bligh-Dyer法和Matyash法。其中Folch法使用氯仿-甲醇-水(8：4：3, v/v/v)混合溶劑對生物樣品進行全脂提取, Bligh-Dyer法在上述方法的基礎上進行了改進, 使用相同溶劑體系但不同體積比(2：2：1。8), 以此減少溶劑用量, 縮短提取時間, 并且還可減少有毒試劑氯仿的使用。氯仿與甲醇的混合體系能在多種復雜基質中非選擇性地提取出各種脂質分子, 水相的加入可以增強相分離, 減小脂質在水相中的溶解度, 從而提高萃取效率。

　　1.2 固相萃取

　　SPE是利用不同物質在固液兩相中相互作用的差異實現分離的, 其具體操作是先使被分析物吸附到固定相上, 然后使用不同洗脫能力的溶液(流動相)分步洗脫, 實現樣品的分離、純化與富集, SPE常被用于脂質的萃取。一般來說, SPE常用于LLE之后, 目的是去除萃取液中的干擾物質或特異性富集某一類或某幾類脂質, 以用于靶向脂質組學分析。

　　相對于SPE, 固相微萃取(SPME)使用溶劑量少, 分析速度快。SPME常使用一根帶有涂層的纖維用于萃取分析物, 基于靜電作用、離子交換作用、疏水相互作用等作用力, 目前使用較多的涂層有聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚苯胺(PANI)等。

　　SPME技術常與GC或GC-MS結合用于揮發性物質的分析, 如頂空-GC(HS-GC)的進樣針首先在一定條件下對固體、液體或氣體樣品進行萃取吸附, 進而在進樣口實現洗脫/解吸附并完成進樣。此外, SPME也可與全二維GC(GC×GC)分析結合, 借助高靈敏的質譜檢測技術用于環境污染物和農用化學品的檢測。目前, SPME結合GC-MS已成功用于多種樣品中脂肪酸或脂肪酸酯的分析, 如水果、牛奶、白酒等。盡管SPE/SPME方法所用小柱或涂層容易達到飽和, 成本較高, 但具有樣品和溶劑消耗少、分析速度快、易于自動化的優點, 適用于極少量樣品、大規模樣品及原位分析。

　　1.3 其他萃取技術

　　近年來, 除了LLE與SPE方法外, 許多其他方法也已用于脂質組學樣品前處理中, 如微波輔助提取法(MAE)、超聲輔助提取法(UAE)、超臨界流體提取法(SFE)等。MAE主要利用微波的能量在萃取過程中提高溫度和壓力, 從而加快萃取速度, 提高萃取效率, 并且減少有機溶劑的用量。由于萃取過程中溫度的升高, MAE可能造成熱不穩定性物質的分解。

　　UAE是利用超聲波產生的機械振動、擴散等效應加速兩相間物質傳遞, 從而實現萃取的技術。與MAE不同的是, UAE過程中不會升溫, 有利于熱不穩定性物質的分析。此外, UAE可與LLE相結合, 進一步提高樣品中被分析物的萃取效率。

　　超臨界流體是指溫度與壓力均處于臨界值以上的流體, 具有低密度與高擴散性的特點, 適合于樣品的萃取或分離。SFE中最常用的超臨界流體是CO2, 其臨界壓力(7。4 MPa)與溫度(31 ℃)均較低, 并且無毒害, 易于去除。超臨界CO2的極性與戊烷相近, 適合于疏水性物質的萃取。用甲醇、二氯甲烷或水作為添加劑, SFE也可用于極性物質的萃取。

2脂質的化學衍生化技術

　　經過樣品提取的脂質在檢測過程中可能面臨如下挑戰：由于脂質分子種類多樣, 化學性質有所差異, 使得不同脂質分子在MS檢測過程中離子化效率差異顯著； 脂質分子的動態分布范圍較寬, 離子化過程中存在離子抑制效應； 儀器對低濃度物質的檢測靈敏度不足； 用于定量的脂質內標分子不易獲得； 脂質分子存在大量同分異構體, 定性定量困難等。對脂質樣品進行化學衍生化處理可能是解決這些問題的有效手段之一。在脂質組學分析中選擇合適的衍生化方法, 有利于實現離子化效率的提高, 檢測靈敏度的提升, 化合物結構穩定性的增強, 甚至同分異構體的區分等。

　　2.1 針對脂質雙鍵的衍生化反應

　　對于脂質分子的結構確證, 通常基于常規的二級質譜圖, 即通過一些特征碎片得到脂質類別、碳鏈組成及碳鏈位置信息。但是, 碳鏈中不飽和雙鍵的位置信息卻難以獲得。這主要是由于常規的碰撞誘導解離(CID)方式能量較低, 無法達到斷裂碳碳雙鍵所需要的能量要求。

　　臭氧誘導解離(OzID)是一種可以鑒定單/多不飽和脂質的有效方式。OzID利用離子化的脂質與中性的臭氧分子在質譜內發生氣相離子-分子反應, 從而產生帶有雙鍵位置信息的碎片。由于儀器限制, 向質譜內部傳輸的臭氧濃度較低(約109~1012分子/cm3), 因此需要較長的反應時間(~1 s)才能達到檢出信噪比要求, 這就限制了OzID與快速LC的聯用。最近的研究表明, 提高質譜反應區域內臭氧的密度, 可以顯著提高OzID的循環周期。當臭氧分子密度達到~1015分子/cm3時, OzID的反應時間可以減小至100 ms以下, 使得OzID的循環周期與質譜匹配, 并可以結合LC的分離能力進行脂質組學分析。Poad等通過改造離子淌度-飛行時間質譜(IMS-QTOF)的捕獲離子漏斗, 在IMS分析前發生臭氧化反應, 并結合LC建立LC-OzID-IMS-MS方法, 實現了脂質雙鍵位置的鑒定。盡管OzID在分析混合物時有巨大的應用前景, 但該方法目前沒有專用儀器, 通常需要特殊的質譜儀器或對儀器進行改造, 因而使其應用受到限制。

　　近幾年來利用化學反應, 如臭氧化和PB反應衍生等, 在脂質不飽和鍵位置的鑒定方面開展了一系列創新性的研究工作, 解決了長期困擾脂質組學研究中脂質不飽和鍵位置鑒定困難的問題。上述反應是較為通用的雙鍵加成反應, 理論上適用于所有不飽和脂質的分析, 但由于反應效率相對有限, 在低豐度不飽和脂質分析中仍面臨挑戰。

　　2.2 針對脂質極性頭基的衍生化反應

　　衍生化反應通常需要根據研究目的及待測物上的活性基團, 選擇合適的衍生化試劑。在此基礎上, 為提高定量的準確性, 進一步發展出了穩定同位素標記衍生化(SILD)方法, 其原理是分別用輕質和重質同位素標記的衍生試劑與樣品和標準品反應, 按一定比例混合后進樣, 根據結果中輕標和重標衍生產物的比值即可對相應組分進行相對定量。與常規衍生化方法相比, SILD有利于解決樣品基質干擾嚴重、內標不易獲得等問題, 從而提高定量準確性。

結論與展望

　　綜上所述, 合適的樣品前處理方法在脂質組學研究中至關重要, 它不僅決定組學數據的質量, 方法的檢測靈敏度, 甚至包括方法的應用范圍。發展樣品中全脂的提取方法是非靶向分析的關鍵； 對于脂質的靶向分析, 選擇性的脂質提取通常需要多種方法相結合, 如LLE與SPE等。減少有機溶劑用量、使用低毒或無毒溶劑、操作簡便快速、提高萃取效率、提升自動化水平等已成為脂質提取方法的發展趨勢。針對樣品中不易檢測的物質, 化學衍生化提供了一種可行的策略。該策略中, 衍生化試劑的確定及合成方法是關鍵, 也決定了方法的實用性和可推廣性。因此, 新型、普適性或特異性的衍生化試劑的開發成為主要發展方向, 需兼顧試劑原料易得性、合成條件溫和、反應速度快、效率高等特點。不同類型的脂質及其表達量與諸多疾病密切相關, 優良的樣品前處理技術對于提升脂質組學數據質量、研究脂質生理功能、發現脂質相關疾病標志物等研究提供重要的技術支撐, 對脂質組學的發展具有重要意義。

　　宋詩瑤, 白玉*, 劉虎威

　　色譜, 2020, Vol. 38 Issue (1)： 66-73

　　DOI： 10.3724/SP.J.1123.2019.07011

長按二維碼關注公眾號《色譜》