實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」
1. 使用標準的亞克隆技術，將編碼誘餌蛋白的 DNA 插入 PEG202 的多克隆位點構建誘館質粒（pBait）。
2. 按照乙酸鋰酵母轉化法用 pBait 和 pSH18-34 （lacZ 報道載體）轉化相互作用阱篩選酵母株（EGY48）。
3. 將轉化株涂布到 Glu／CM-His、-Ura 平板上，放置于 30℃ 培養箱中。
4. 進行 lacZacZ 激活和亮氨酸需求平板檢測以確保誘餌蛋白不會自己激活報道基因。
5. 用阻遏測試法確定誘餌蛋白的合成。
6. 將轉化的 EGY48（步驟 3）接種到 20 ml Glu／CM-His、-Ura 液體培養基，于 30℃ 振蕩過夜。
7. 測量 OD600 吸光值，在 250 ml Glu／CM-His、-Ura 培養基中稀釋至 5×106 細胞／ml。 0.1 的 OD600 相當于大約 3×106 細胞／ml。這個數值應當在每個應用的酵母株得到確認。
8. 于 30℃ 振蕩培養細胞至 OD600 為 0.6～0.8 （約 5～6 h）。
9. 將培養液分為 5 個 50 ml 圓錐形離心管中，室溫下于 3000 g 離心 5 min。
10. 棄上清，將酵母沉淀重懸于 25 ml 無菌水中，重復離心。
11. 棄上清，將酵母沉淀重懸于 1 ml 100 mmol／L 乙酸鋰中。移到一 1.5 ml 微量離心管中，室溫下 20800 g 離心 15 s 沉淀酵母。
12. 吸去上清，重懸酵母于 350 ul 100 mmol／L 乙酸鋰中（終體積約 500 ul）。
13. 將每個管中的溶液分為 10 個 50 ul，室溫下 20 800 g 離心 15 s 沉下酵母。
14. 吸去上清，依次加入下列成分： 240 ul 50％（m／V）PEG 3350 36 ul 1 mol／L 乙酸鋰 50 ul 2 mg／ml 單鏈載體 DNA （100 ug） 25 ul 40 ug／ml 肽適配體庫 DNA （1 ug）。 在使用前，單鏈載體 DNA 需要加熱到 95℃ 放置 5 min， 然后放冰上冷卻。
15. 劇烈振蕩轉化混合物直至酵母沉淀完全重懸起來，然后于 30℃ 孵育 30 min。
16. 于 42℃ 熱激 20 min。
17. 室溫下 20 800 g 離心 15 s 沉下酵母。
18. 吸去上清，重懸酵母于 500 ul 無菌水中。
19. 將 48 個轉化株分別涂布到單獨的 15 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 平板上。
20. 兩個剩下的轉化株各取 400 ul 涂布到 15 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 平板上。
21. 用剩下的 100 ul 測定轉化效率。用水進行一系列 10 倍的稀釋，然后涂布到 10 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 平板上。
22. 于 30℃ 孵育 2～3 天（直至克隆的直徑約為 1 mm）。
23. 將 50 個轉化平板上的酵母（步驟 19、20）收集到的一個 50 ml 的離心管中。
24. 加入等體積的 2×甘油存儲液到收集的酵母細胞中。分裝為 1 ml 的小份并存儲于 -70℃。
25. 檢測凍存的小份酵母的平板效率。
26. 接種肽適配體庫的 10 個庫等價物到 2 ml Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp 液體培養 基中。于 30℃ 振蕩培養 4 h。 一個庫等價物等于含有肽適配體庫的酵母轉化株的總數，如步驟 21 所檢測的。
27. 室溫下于 3000 g 離心 4 min。
28. 吸去上清，重懸酵母于 1 ml 無菌水中。
29. 將酵母以 106 個酵母細胞／平板的密度涂布到 15 cm Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu 的平板上。
30. 于 30℃ 培養，每天觀測平板生長情況。
31. 將克隆劃線接種到 10 cm Glu／CM-His、-Ura、-Trp 的主平板上。于 30℃ 培養 1～2 天。
32. 將主平板在下列指示平板上復制：
Glu／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、－Leu Glu／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal
33. 鑒定出在 -Leu 平板上呈半乳糖生長依賴性并且在 X－gal 平板上呈半乳糖依賴的藍色的克隆。
34. 提取所需的肽適配體表達質粒。
35. 以質粒為模板，對肽適配體的可變區進行測序。
36. 為了從 pBait 和 pSH18－34 中分離出適配體質粒，轉化 E.coli 并用擴增硫氧還蛋白的引物通過 PCR 鑒定出正確的轉化株。 展開 | 