實驗方法原理 大腸桿菌中異源性的 RNA-BP 與靶 RNA 的結合會抑制靶基因的翻譯。此方法已成功地應用于包括 HIV Rcv 蛋白和核仁素（nucleolin）在內的多種 RNA-BP 的研究中。
實驗材料 質粒菌株
試劑、試劑盒 X-Gal 儲液IPTG 儲存液lacZ 緩沖液ONPG 溶液碳酸鈉溶液β-巰基乙醇SDS氯仿
儀器、耗材 檢測指示板
實驗步驟
―、材料與設備
1. 質粒：pREV1，pLacZ-Rep，pACYC184。
2. 菌株：WMI 和 WMI/F'。
3. X-Gal 儲液：30 mg/ml X-Gal 以二甲基甲酰胺溶解，-20℃ 保存。
4. IPTG 儲存液：1 mol/L IPTG 以水溶解，20℃ 保存。
5. lacZ 緩沖液：60 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4（pH 7.0）。
6. ONPG 溶液：4 mg/ml ONPG 溶解于水中，4℃ 保存。
7. 1 mol/L 碳酸鈉溶液。
8. β-巰基乙醇。
9. SDS。
10. 氯仿。
11. 檢測指示板：LB-瓊脂板，含 100 μg/ml 氨芐青霉素，35 μg/ml 氯霉素，60 μg/ml X-Gal，和（或）IPTG。
12. 培養液：含 100 μg/ml 氨芐青霉素，35 μg/ml 氯霉素，和/或 IPTG 的 LB 培養液。
二、操作方法
1. 報道質粒 pLacZ-Rep 的構建
利用 PCR 將待研究的 RNA 靶分子序列克隆到質粒 pLacZ-Rcp。RNA 靶分子序列應盡量接近 SD 序列，使 RNA-BP 與靶 RNA 結合后產生最大的轉錄抑制效應。pLacZ-Rep 質粒中兩個單一的限制酶位點 KpnⅠ 和 HindⅢ 可作為靶 RNA 分子序列的插入位點。
2. RNA-BP 表達質粒的構建（pREV1 )
質粒 pREV1 編碼 HIV-1 Rev 蛋白，Rev 基因上游有 ClaⅠ和 NdeⅠ兩個單一的限制酶位點，Rev 基因下游有 SalⅠ和 Bsu36Ⅰ兩個單一的限制酶位點；利用這些酶切位點將 Rev 基因切除，換為 RNA-BP 的編碼序列。質粒克隆過程中要注意讀碼框是否吻合，并 保證插入的 RNA-BP 編碼序列中盡量不含用于克隆的限制酶識別位點；若實在避不開上述位點，也可以根據情況采用其他的限制酶進行替換。
3. 轉錄抑制的檢測
將構建好的報道質粒和 RNA-BP 表達質粒共轉化大腸桿菌 WM1/F'，涂布于 X-Gal 檢測指示板，37℃ 培養過夜。表達 β-半乳糖苷酶時，細菌克隆呈現藍色，而克隆顏色的深淺與 β-半乳糖苷酶的表達水平直接相關，可以很容易的區分 β-半乳糖甘酶活性相差一倍或一倍以上的克隆。通過報道質粒和 RNA-BP 表達質粒共轉化的細菌克隆與報道質粒和對照質粒 pACYC184 共轉化的細菌克隆之間的比較，就可以判定 lacZ 的表達是否被 RNA-BP 表達所抑制。藍色明顯減弱的克隆說明 RNA-BP 的表達引發了轉錄抑制。
在實驗過程中需要確定 RNA-BP 表達的最佳條件，但應注意某些 RNA-BP 高水平的表達可能對菌株產生毒性。表達 RNA-BP 的質粒 pREV1 的啟動子受 lac 抑制因子調節，因此在含有較高水平的 lac 抑制因子的菌株（如 WM1/F' ) 中，RNA-BP 的轉錄被抑制。這些菌株中可以在 lac 誘導試劑 IPTG 存在的情況下獲得 RNA-BP 基因中等程度的轉錄。
(1) 觀察轉錄抑制效應
① 將構建好的報道質粒和 RNA-BP 表達質粒共轉化大腸桿菌菌株 WM1/F'，同時以報道質粒和對照質粒 pACYC184 共轉化大腸桿菌菌株 WM1/F' 作為陰性對照。
② 將轉化后的細菌分成小份，分別涂布含有 0 μmol/L，1 μmol/L，2 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，50 μmol/L 或 100 μmol/L IPTG 的 LB-瓊脂檢測指示板，37℃ 培養過夜。
③ 次日，比較不同轉化株與對照轉化株之間的顏色差別 ( 必須注意要在同樣的 IPTG 濃度的板之間進行比較），確定能夠明顯觀察到 RNA-BP 轉化株與對照質粒轉化株之間顏色差異的檢測指示板的最低 IPTG 濃度。
(2) β-半乳糖苷酶活性檢測
① 從上一反應中獲得的可明顯觀察到 RNA-BP 轉化株與對照轉化株之間顏色差異的最低 IPTG 濃度檢測指示板上挑取 4~6 個克隆至含氨芐青霉素、氯霉素和 IPTG 的 LB 培養液中，同時挑取對照菌株。37°C 振搖過夜。
② 接種 45 μl 過夜培養物至 1.5 ml 含氨芐青霉素、氯霉素和 IPTG 的 LB 培養液中，37℃ 振搖 1.5~2.0 h（OD600 約為 0.5）。
③ 將樣品置于冰上 20 min。
④ 將樣品倒入聚苯乙烯管，檢測 OD600，以培養液做空白對照。
⑤ 準備幾個玻璃試管，分別加入 0.5 ml lacZ 緩沖液，0.01% SDS 和 50 mmol/L β-巰基乙醇，各滴兩滴氯仿，再在各管內分別加入 0.5 ml 細菌培養液。同樣以培養液做空白對照。劇烈振搖 15 s，28℃ 水浴反應 5 min。
⑥ 在各管內加入 200 μl ONPG 溶液，開始計時；28°C 水浴反應直至管內液體變黃。
⑦ 加入 0.5 ml 1 mol/L 碳酸鈉溶液，振搖終止反應，同時記錄各管的反應時間。若 3~5 h 仍無明顯顏色變化，也一樣終止反應。將反應后的樣品轉入微量離心管，16000 g 離心 5 min，將上清轉移到聚苯乙烯管，小心避免混入氯仿。
⑧ 讀取 OD420，減去空白培養液管的數值。
⑨ 每個細菌培養樣品的 β-半乳糖苷酶活性（miller unit ) = （2000 X OD420）/（△t X OD600），△t 表示 ONPG 水解反應的分鐘數。
假設實驗過程中誤差極小，RNA-BP 的表達完全不影響細菌的生長，各個單獨的克隆生長狀態均很好，樣本之間 β-半乳糖苷酶活性的變化也很小，這種情況下 RNA-BP 的抑制活性是可以定量的。因此，在任何 IPTG 濃度條件下，如果報道質粒和對照質粒共轉 化的菌株中 β-半乳糖苷酶的平均活性為 X，報道質粒和 RNA-BP 表達質粒共轉化的菌株中 β-半乳糖苷酶的平均活性為 Y，抑制率 R 就可以計算（R=X/Y)。抑制率體現的是大腸桿菌中 RNA-RP 與靶 RNA 結合后對翻譯的抑制程度。在后面將要介紹的一些實驗中，一般要求 RNA-BP 對報道蛋白表達的抑制最好達到 5 倍或 5 倍以上；若 R≤5，則應提高 IPTG 的濃度以表達更多的 RNA-BP。另一方面，如果在某一 IPTG 濃度下，各個表達 RNA-BP 的菌株之間 β-半乳糖苷酶活性的差異較明顯，可能預示表達的 RNA-BP 對細菌產生了毒性，此時就需要降低培養時的 IPTG 的濃度。
一旦檢測到 RNA-BP 對報道基因表達的抑制作用，就需要進一步確定這種抑制作用是由 RNA-BP 與靶 RNA 之間的特異性的結合所導致的，最簡單的方法就是在 RNA-BP 編碼序列或靶 RNA 中導入突變，這將會影響到二者的結合。
4. 大腸桿菌系統的應用
(1) 確定能夠影響 RNA-BP 與靶 RNA 之間結合的突變
在檢測到 RNA-BP 與靶 RNA 之間的特異性結合對報道基因表達的抑制作用后，此大腸桿菌系統就可以用來篩選影響 RNA-BP 與靶 RNA 之間親和力的 RNA-BP 的突變位點了，這種篩選突變體方法是基于大腸桿菌中 RNA-BP 與靶 RNA 之間的親和力與其對翻譯的抑制作用相關之上的。因此在大腸桿菌中，能增強 RNA-BP 與靶 RNA 之間親和力的 RNA-BP 突變體對 lacZ 合成的抑制作用比天然 RNA-BP 要強，而減弱 RNA-BP 與靶 RNA 之間親和力的 RNA-BP 突變體對 lacZ 合成的抑制作用則比天然 RNA-BP 要 弱。通過觀察轉化菌株的顏色變化就可以從 RNA-BP 突變體庫中篩選得到能增強或減弱 RMA-BP 與靶 RNA 之間親和力的突變類型。
采用遺傳學的方法可以對上述方法進行一些改變來研究 RNA-BP 與其靶 RNA 序列之間的相互作用，其中最為常用的是將 RNA-BP 進行不同的突變來研究這些突變對其與 RNA 結合及報道基因翻譯抑制的影響。對 RNA-BP 進行全面的突變可以幫助研究者確定 RNA-BP 與 RNA 結合的表面（RNA biding surface )。如果對 RNA-BP 與靶 RNA 之間的結合知之甚少，最好的研究方法是對RNA-BP 進行隨機突變，然后篩選影響報道基因 lacZ 合成的突變體，經過測序就可以確定哪些氨基酸的改變會影響 RNA-BP 與靶 RNA 之間的結合。如果知道哪些區域影響兩者之間的結合，就可以縮小突變的范闈。在實驗中，對突變頻率也應加以控制，最好將整體突變頻率保持在每個基因含有一個或一個以下的突變。突變頻率過低會增加為篩選得到影響相互作用的突變株所需的篩選工作量，而突變頻率過高會使結果分析變得復雜。
當僅僅需要對一小段區域進行突變時，最方便的方法就是合成一小段與要突變區域對應的寡核苷酸，然后將其整合到 RNA-BP 編碼序列中。為方便此操作，pREV1 質粒中含有一個 f1 噬菌體復制起始位點，可以合成單鏈 DNA，這是一些進行寡核苷酸突變過程 中的中間體。當對大于 50 或 100 個堿基的較長的編碼序列進行突變時，目前常用的方法是易錯 PCR（error prone PCR）。
制備出突變體質粒庫后，可以直接轉化已預先轉化有報道質粒的菌株；也可以先經過電轉化感受態細菌，在菌體內擴增后再轉化已轉化有報道質粒的菌株。轉化后的細菌涂布檢測指示板，同時涂布野生型 RNA-BP 與報道質粒共轉化的菌株作為對照，37℃ 培養過夜后挑取顏色與對照轉化株不同的克隆。
盡管采用這種方法得到的不少陽性克隆中的 RNA-BP 同靶 RNA 間的親和力發生了改變，但是有一部分陽性克隆中 lacZ 表型的變化并非 RNA-BP 同靶 RNA 間的親和力改變所致，而是由于轉化株中 RNA-BP 的表達量發生了改變。一種區分這兩種導致細菌表型改變的原因的簡單方法是分別制備對數生長期細菌（包括野生型 RNA-BP 與報道質粒共轉化的對照菌株和表型發生了改變的待測菌株）的蛋白裂解液，經丙烯酰胺凝膠電泳，染色或 Western 印跡檢測對 RNA-BP 的表達進行定量，篩除 RNA-BP 表達量明顯改變的轉化株。進一步的研究就可以集中在表型改變顯著而 RNA-BP 的表達量無明顯變化的轉化株了。當無法直接觀察到 RNA-BP 的表達水平時，也可以采用間接的方法通過對細菌生長的抑制程度來對 RNA-BP 的表達量進行判定。間接的檢測方法是在不含 IPTG 的培養液中過夜培養野生型 RNA-BP 與報道質粒共轉化的對照菌株和突變體 RNA-BP 與報道質粒共轉化的待測菌株，將已達生長平臺的過夜培養菌按 1：100 的比例分別接種（培養液中 IPTG 濃度略微抑制野牛型 RNA-BP 表達），37℃ 振搖 2~3 h，檢測 OD600。與野生型 RNA-BP 與報道質粒共轉化的對照菌株 OD6000 值一致的突變體轉化本中的 RNA-BP 表達水平應該比較一致，而 OD600 值相差較遠的轉化株可以丟棄。
得到了一系列的表型改變的轉化本后，需要通過 β-半乳糖苷酶活性檢測來對結果進行進一步的確認。在進行進一步的分析之前，需要提取并純化質粒 DNA，然后再轉化含有報道質粒的菌株，繼而進行 β-半乳糖苷酶活性檢測。在這部分實驗中，可以找到參與 RNA-BP 與靶 RNA 結合的氨基酸。
此外，通過與突變 RNA-BP 編碼序列類似的方法即對靶 RNA 序列進行突變也同樣可以為研究 RNA-BP 與靶 RNA 間的相互作用提供有意義的信息。在這一實驗中，將突變好的報道基因質粒庫轉入含有野生型 RNA-BP 的菌株中，同樣經過表型篩選和 β-半乳糖苷酶活性檢測，最后篩選得到的是靶 RNA 中影響其與 RNA-BP 相互作用的核苷酸序列。
(2) 評估 RNA 突變體或 RNA-BP 突變體的結合親和力
建立的大腸桿菌系統可以高水平的表達 RNA-BP 和低水平表達 lacZ 報道基因。簡單的翻譯抑制模型揭示：大腸桿菌中 RNA-BP 的翻澤抑制強度與 RNA-BP 和靶 RNA 之間的親和力相關。這一假設通過采用純化的蛋白和 RNA 來分析 RNA-BP Rev 和核仁素的不同突變體同靶 RNA 的解離常數對翻譯抑制的影響得到了證實。研究人員分別構建了一系列 Rev 和核仁素的突變體，用 RNA 凝膠移位結合試驗（gelshift RNA-binding assay）檢測 RNA-BP 與靶 RNA 復合物的解離常數，同樣的 RNA-BP 與靶 RNA 復合物在大腸桿菌系統中也進行了體內的抑制率（R）的檢測。以解離常數 Kd 的對數對抑制率（R-1）的對數進行作圖，Rev 和核仁素的突變體均得到吻合度很好的一 條直線（表明二者線性相關）。RNA-BP Rev 和核仁素的這種規律可能也適用于其他的 RNA-BP。此外，如果在構建了一系列的突變體后，選取其中的 6 至 8 個突變體進行純化并采用胞外方法檢測解離常數 Kd，采用胞內方法檢測抑制率 R，繪出標準曲線；則若通過試驗測得了其他突變體的抑制中，就可以利用標準曲線推算得到此突變體的解離常數 Kd 。
