簡介
在過去的五年中，熒光蛋白在監測體內生物學研究中，起到越來越重要的作用。源于維多利亞多管發光水母中的綠色熒光蛋白(GFP)是最早被我們應用的熒光蛋白，但是隨著時間的推移，現在我們可以使用的熒光蛋白種類也越加豐富，包括加強型的變異GFP蛋白、從其他種類水母中發現的熒光蛋白和珊瑚礁蛋白。它們都可以在眾多的細胞和組織中被克隆復制，從細菌到酵母，從植物到哺乳動物。這些熒光蛋白穩定、細胞毒性小、而且不需要額外的輔助也能在體內產生可見的熒光。因此，它們可以被用作分子靶標或者獨立的報告因子去視化、追蹤和定量多種不同的細胞進程，包括細胞合成與代謝，蛋白轉運，基因誘導和細胞譜系。不同的熒光蛋白具有不同的顏色，因此也可被用于多重檢測。這些熒光蛋白都能被熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測到。但是相應的，如果我們不做細胞分選或監測細胞內遷移，具有熒光功能的微孔板讀板機將是一個更好、更方便和更高通量的選擇。下面，我們將會向大家展示Molecular Devices微孔板讀板機如何利用“無創”技術檢測活細胞熒光蛋白。我們將從Clontech公司獲得的三株HEK-293細胞系進行不同熒光蛋白的穩定轉染。這次研究的目的：1）優化三株細胞系的波長設置，2）通過稀釋細胞系來確定檢測下限LLD，3）證明在一種細胞系中識別另一種細胞系的可行性。
優勢
- 簡單易用的“無創”技術檢測活細胞中熒光蛋白
- 隨意可調設置針對每種染料優化最佳波長組合
- 熒光底讀檢測獲得最優結果
材料
- HEK-293細胞系穩定表達三種熒光蛋白：
- AcGFP-多管發光水母中產生的另一種GFP(但不同于維多利亞水母)
- ZsGreen-與GFP相似，但更(來自珊瑚礁)
- DsRed-一種來自珊瑚礁的紅色熒光蛋白
- 非轉染的HEK-293細胞系，作為對照
- DME: High Glucose(Irvine Scientific cat. #9024)
- G418: Geneticin(Gibco cat. #11811-031)
- FBS (Irvine Scientific cat. #3000A)
- Glutamine/Pen/Strep Solution(Gibco cat. #10378-016)
- Trypsin/EDTA 1X in HBSS(Irvine Scientific cat. #9341)
- 10X Hank’s Balanced Salt Solution(Gibco cat. #14065-056)
- 1M HEPES(Irvine Scientific cat. #9319)
-
HBSS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20 mM HEPES buffer):
Made from 10X Hank’s Balanced Salt Solution (100 mL), 1M HEPES (20 mL)
and water for cell culture (880 mL)
- 細胞培養用水(Irvine Scientific cat. #9312)
- 黑色透明平底96孔板(Corning cat. #3603)或黑色透明平底384孔板（Corning cat. #3712）
方法
細胞準備與分析
細胞都培養在大燒瓶中，應用含10%FBS+1%Pen/Strep/L-glutamine+500μg/mLG418的DMEM的培養基。沒有轉染的HEK-297細胞作為對照。在實驗前一夜，對細胞進行胰酶消化，然后進行密度梯度稀釋，最終密度范圍為從500,000到100個細胞每毫升。然后把它們過夜接種到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此，接種的細胞密度就是50,000到10個細胞每孔(96孔板)和12,500到2.5個細胞每孔(384孔板)。每個稀釋都做12個重復。第二天分別用SpectraMaxM5和GeminiEM兩臺儀器對微孔板進行底讀和頂讀檢測。
波長優化
SpectraMax M5和Gemini EM都是基于單色器的掃描式具有熒光功能的微孔板讀板機。針對每一個特殊熒光染料，其激發波長和發射波長都可以在背景之上進行信號優化，這點也是濾光片式微孔板讀板機所不具備的。總的來說，優化策略就是：用低于理論最大激發波長20-25nm的激發光激發，然后初掃發射波長；其次用高于理論最大發射波長20-25nm的發射光掃激發波長。掃描后將給出實際的激發與發射波長。最后可以結合信號/背景分析再做其他額外的掃描來確定最終的結果。(根據斯托克頓位移理論，激發波長應該更低、發射波長應該更高，并且需要一個發射光阻隔濾片來隔離掉非目的波長的光信號)。而且可能還會因為要選擇最佳阻隔濾片而再進行兩次掃描。
