結果
波長優化
用GeminiEM對DsRed進行波長掃描，以此舉例如何進行波長優化。為了檢測最大激發波長，我們首先固定發射波長為600nm，然后對發射波長進行掃描。掃描結果顯示最大激發波長為556nm(圖1)。同樣為了檢測最大發射波長，我們固定激發波長為535nm，然后掃描發射波長，從而得到584nm的結果(圖2)。激發與發射值都與被發表的波長結果557/579相近。
下一步就是要結合信號/背景優化結果確定最佳激發和發射波長。因為初步檢測結果的斯托克位移偏小(22nm)，顯然是要通過降低激發波長和增大發射波長來擴大兩者之間的差異，其次還需要找到合適的發射光阻隔濾片優化最佳靈敏度。最終，我們使用550nm的激發波長來激發，同時使用570nm的發射光阻隔濾片隔離掉不想要的高于570nm以上的激發光。通過575到600nm的發射波長掃描DsRed轉染的細胞，結果顯示在587-588nm處會有峰值出現(圖3，上面的曲線)。背景(沒有轉染的細胞)區域中，點就相對比較平緩(圖3，下面的曲線)。基于本次掃描，我們最終優化的設置為550nm激發、588nm發射、575nm作為發射光阻隔濾片。
觀察到的最大值與我們建議用于定性分析的設置都總結在列表1中。
細胞稀釋的結果
采用底讀得到的細胞稀釋結果詳見圖4(96孔板)和圖5(384孔板)。頂讀結果詳見圖6(96孔板)和圖7(384孔板)。ZsGreen細胞系(上面的曲線)的亮度是其它兩種細胞系的將近3.5倍。盡管DsRed細胞系的結果暗于ZsGreen，但兩種細胞系的檢測靈敏度卻相近(列表2的下圖)，因為背景值低于DsRed的波長。總的來說，圖中的點稍微有些非線性，最上方會有一點下降。我們推斷是因為細胞在高濃度時，會有貼壁生長的趨勢，所以會造成非線性的結果。
列表2給出了所有細胞系確認得到的檢測下限LLD。其中LLD的計算方法是：3*SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(沒有細胞的培養基)的標準差，Slope是曲線底部的斜率。(對于96孔板和384孔板，分別使用了10,000個細胞每孔和2500個細胞每孔的數據)。非轉染細胞的RFU信號和標準差結果都與只含有培養基的結果相似。
在本次實驗中，ZsGreen和DsRed細胞系在底讀模式都有著相似的檢測限，而且兩者都比AcGFP細胞系的檢測下限低3到4倍。本次實驗一共重復了三次，但是DsRed實驗結果并不是每次都能表現的足夠好。在一次實驗中，它的檢測下限近似于AcGFP，但是在另一次實驗中，它的檢測下限又會很高。我們將這些區別歸結于不同細胞系的通道數目不同。(伴隨著一個成功的通道，細胞就會變得越暗)DsRed細胞系在實驗開始階段比其它細胞系長得快，所以在第一次實驗中，它比其它細胞系多2-4倍的通道，結果就顯然不夠理想。
對于AcGFP和ZsGreen細胞系，當采用頂讀時，檢測下限升高將近三倍。另一方面，對于DsRed，當采用頂讀時，檢測下限會升高將近10-20倍。我們認為造成這種靈敏度下降的原因在于DMEM培養基有紅色熒光信號，會對結果有內部干擾。事實也證明，將培養基換成無色的HBSS，相應的DsRed的頂讀結果也會變好。列表3展示了將有色培養基換成無色培養基的結果。底讀并沒有太多改變(盡管AcGFP的檢測下限看起來改善了)，證明這種操作方法并沒有導致細胞的損失。然而頂讀結果卻讓靈敏度改善了將近三倍。這些結果也從某一方面支持了一種理論，那就是有色培養基會一定程度上影響頂讀的靈敏度。
