利用特異性多克隆抗體對磺胺類藥物的免疫分析

實驗概要

磺胺類藥物是一類重要的具有廣譜抗菌作用的藥物，主要用于預防和治療細菌感染性疾病，也常做為飼料添加劑促進動物生長，但不合理的使用造成在動物性食品中殘留，可能對人類的健康造成潛在危害。本試驗利用ELISA檢測磺胺類藥物，有一定的實用價值。

實驗步驟

1. 蛋白螯合

根據UV吸光值測量半抗原/蛋白的摩爾比率評價半抗原螯合蛋白(BSA，OVA)。半抗原/蛋白的摩爾比率基本一致，磺胺類藥物/蛋白質的摩爾比率范圍為20至40；而免疫原和螯合物的比率為3至9；對HRP螯合半抗原/HRPd摩爾比率范圍為2至3。

2. 免疫

免疫原(0.20mg/0.5mLPBS)溶解于0.5mL弗氏完全佐劑中，肌肉注射于雌新西蘭白兔(I和II)。間隔21天注射相同劑量的免疫原，每次免疫后10天兔耳靜脈采血，當觀察到效價不再增強時，收集全血凝聚后4℃保存，分離血清。獲得八種血清(S3-I，S3-II，S4-I，S4-II，S6-I和S6-II)，所有血樣4℃保存于50%飽和硫酸銨。

3. 血清的篩選

根據吸光值范圍從0.5到1.2缺乏分析物，選擇最佳的包被原結合物濃度，血清稀釋滴度，酶標示蹤劑。使用非競爭性ELISA檢測血清對不同包被原的親和力，通過稀釋血清從1/1,000  - 1/64,000，測定抗血清的結合。包被原濃度為0.01 到 0.25 mg L^-1。同理，通過抗體包被ELISA滴度從0.125 - 2.0 mg L^-1檢測酶標追蹤物，板子包被血清濃度從1/1,000到 1/10,000。

4. 抗體包被形式

ELISA板被包被100uL/每孔經CB適度稀釋的抗體，4℃過夜。第二天用PBS-T洗板6次，每孔加入50 uL 溶于PBS-T的HRP-半抗原和50 uL雙蒸水，室溫孵育1小時，洗干凈后，通過每孔加入100 uL 底物(2mg/mLOPD和0.012%H₂O₂在25mmol/L檸檬酸鈉鹽，62mmol/L磷酸鈉鹽，PH5.5)檢測HRP追蹤活性，

5．結合物包被形式

ELISA板每孔加入100uL適當濃度的用CB稀釋的OVA-半抗原包被，4℃孵育過夜。洗板6次，每孔加入50 uL 適度稀釋的血清和50  uL雙蒸水，室溫孵育1小時進行競爭分析。洗板，然后加入100uL以1:4000的山羊抗兔抗體(GAR-HRP)，檢測過氧化物酶活性。

6．最優化ELISA

對不同化學條件的影響(離子強度、pH值、表面活性劑濃度)進行了研究，檢測免疫的敏感度。用PBS-T稀釋 0，0.5，1.0，2.0，3.0 和 5.0，pH 7.5.檢測離子的強度的有效性。PH的有效范圍為4-9.5。表面活性劑的有效性為20吐溫。

7. 交差反應的檢測

通過測試一系列磺胺類藥物和感染復合物的交差反應表達的百分比對STZ的特異性ELISA分析檢測。

8.  STZ標品的準備

STZ(24mg/mL)溶于0.5mol/LNaOH中，保存于4℃。用去離子水稀釋成240 mg/L的工作液。用去離子水倍比稀釋成標準溶液(STZ 濃度從2×10^-4至2×10-²)，然后制備標準曲線。

文獻：Specific  polyclonal-based immunoassays for sulfathiazole. Nuria Pastor-Navarro,  Cristina García-Bover, ángel Maquieira and Rosa Puchades. Analytical and  Bioanalytical Chemistry. Volume 379, Numbers 7-8 (2004), 1088-1099,  DOI: 10.1007/s00216-004-2683-1