利用CRISPR來對付HIV：激活它還是去除它？

　　全球感染慢病毒HIV-1的人數已經超過了2500萬。如今，人們可利用抗病毒療法來控制HIV-1，使得病毒在血液中檢測不到。不過，病毒沒有完全消失；它只是隱藏在潛伏感染的細胞中。為了真正治愈HIV-1，研究人員需要打敗這些隱藏的病毒庫，而CRISPR有望完成這一艱難的工作。

　　美國天普大學Kamel Khalili的實驗室證明，利用CRISPR來對付HIV有兩種可能的策略：利用dCas9-SAM來激活HIV-1的轉錄并摧毀被感染的細胞；利用野生型的Cas9從被感染的細胞中去除HIV-1基因組。Mary Gearing在Addgene的博客上介紹了如何在體外利用CRISPR來對付HIV-1，以及臨床上必須克服哪些障礙。

　　抗逆轉錄病毒療法

　　HIV-1感染免疫系統中的細胞，特別是CD4+ T細胞，最終導致個體患上獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）。抗逆轉錄病毒療法（ART）幾乎可以消除血漿HIV-1，提高HIV-1患者的預期壽命和生活質量。不過，ART并不能治愈HIV-1。在停止治療后，患者的病毒水平會迅速恢復到治療前的水平，因為潛伏感染的細胞中存在病毒庫。

　　同時，雖然患者檢測不到血漿HIV-1，但其他慢性病的風險增加，包括癡呆、腸紊亂、神經損傷以及心臟病。為什么機體不能激發免疫反應來摧毀這些病毒庫？實際上，免疫系統根本沒有到威脅。潛伏感染的細胞很少產生病毒蛋白，因而逃過了免疫檢測。為了解決這個問題，人們提出了兩種策略。

　　激活并殺死

　　為了激活并殺死HIV感染的細胞，研究人員之前使用組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑來增加HIV-1基因組的轉錄。在靶向方法中，Zhang等人利用了CRISPR/Cas9協同激活介質（SAM）系統。這個系統利用dCas9-VP64來激活轉錄，并借助兩個激活結構域（MS2和p65）來增強轉錄激活。

　　Zhang等人設計了多個gRNA來靶定HIV-1基因組的5’-LTR，并發現SAM靶定在NF-KB結合位點附近的增強子區域，能增強HIV啟動子-熒光素酶重組子的激活。在多個HIV-1潛伏T細胞系中，用CRISPR/Cas9 SAM治療能增加HIV-1激活的比例。在能夠產生HIV-1毒性蛋白的細胞系中，CRISPR/Cas9 SAM導致細胞凋亡，說明了真正的“激活并殺死”反應。

　　將HIV-1趕出去

　　之前有人利用鋅指核酸酶（ZFN）來切割HIV-1基因組，不過研究人員認為CRISPR/Cas9可以提高效率，并降低脫靶效應的可能性。在這種療法中，CRISPR/Cas9需要切割每個感染細胞的HIV-1基因組，并預防那些細胞的再次感染。Kaminski等人設計了靶定HIV-1 5’和3’-LTR的gRNA，并與Cas9一起表達。PCR擴增和Sanger測序表明，大部分的HIV-1基因組都已被切割，只有小部分的LTR連在一起。重要的是，未檢測到脫靶效應。研究人員觀察到，Cas9/gRNA的表達對細胞活力、細胞周期進程或凋亡沒有負面影響。

　　Kaminski等人接著在HIV-1感染的T細胞中檢測了他們的方案。他們從健康個體中分離CD4+ T細胞、擴增，并用HIV-1感染。對于兩種HIV-1病毒株，Cas9/gRNA慢病毒表達明顯降低了HIV-1拷貝數，不過病毒株之間的效率差異達48-100%。此外，對于從兩名HIV-1感染患者中分離出的CD4+ T細胞，CRISPR也讓HIV-1拷貝數降低50%以上。盡管這是個激動人心的結果，但需要注意的是，這些患者是是ART-naive的，因此這個實驗模擬了HIV-1活性感染期，而不是大多數患者的ART誘導的病毒控制。

　　CRISPR HIV-1治療的障礙

　　這兩種方法都代表了HIV-1臨床前研究取得了令人振奮的進展，但很難說哪一種方法會成功。“激活并殺死”的優勢在于殺死被HIV-1感染的細胞，且不需要功能Cas9核酸酶，因此無異常DNA切割的可能性。直接的HIV-1切割允許T細胞存活，但為了防止再感染，需要持續表達Cas9/gRNA，這可能會造成較高的脫靶效應。

　　在這兩種情況下，將體外工作轉移到動物模型有兩個主要障礙。第一是如何將CRISPR導入所有靶細胞。考慮到病毒庫覆蓋多個器官系統，這個目標很難實現。在感染的早期，當HIV-1限于一部分T細胞時，這兩種方法都更為成功，但不清楚是否有足夠的T細胞來銷毀一個病毒庫。

　　第二個挑戰是序列特異性。抗病毒療法在蛋白結構水平上靶定HIV-1，但CRISPR gRNA需要DNA序列的特異結合。患者的HIV-1基因組需要經過測序，才能確定最佳的gRNA，且每個gRNA需要經過驗證，以確保高的on-target結合和低的off-target結合。HIV-1也可能對CRISPR療法形成耐藥性。多個gRNA有望解決這個問題。

　　就目前而言，盡管將這些研究成果轉化成療法還存在一定的困難，但這些文章呈現出了激動人心的證據，說明治愈HIV-1也許是我們力所能及的。未來，隨著CRISPR體內導入取得進展，這有望為許多常見病的治療帶來可能。