利用CRISPR來治療杜氏肌營養不良：對付最大基因有新招

　　胚胎發育是一個不可思議的復雜過程，在這個過程中數百萬個分子和細胞事件陸續發生。然而，對于這個精巧的生物學過程，有時即使是單個核苷酸的改變也會嚴重地改變生活。

　　杜氏肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy，簡稱DMD）就是一個明顯的例子。據統計，在全球范圍內，每3500名新生男嬰中就有1名罹患此病。由于抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因發生突變，肌肉細胞變得脆弱，肌肉被浪費掉，導致那些患病男孩在十幾歲或二十幾歲時死亡。

　　DMD由單個基因中的突變引起，這使其登上基因治療的候選名單。然而，dystrophin基因是最大的人類基因之一，長達2300 kb，有79個外顯子，因此，傳統的基因治療方法束手無策，根本不可能將巨大的dystrophin基因包裝到小小的病毒載體中。華盛頓大學的研究人員Jeff Chamberlain還表示：“DMD是一種綜合征，所有患者的突變都略微不同，需要多種治療策略。”

　　既然替換基因不是一個好主意，于是研究人員現在轉而采用CRISPR技術來編輯它。使用CRISPR來糾正dystrophin基因，需要細胞具有活躍的DNA修復機制，比如正在分裂的細胞。或者，在成熟的肌肉細胞中，CRISPR可以剪掉包含突變的那部分基因，而不修復它們，讓細胞產生截短但有功能的dystrophin。

　　“基因替換治療在眼下更容易實現，而且比基因編輯更加有效。不過，基因編輯具有巨大的潛力，并且隨著更多的限制被解決，我認為這種方法將逐步用在患者身上，并最終獲得批準，實現廣泛應用，”Chamberlain說。

　　讓小鼠動起來

　　多年來，研究人員一直在研究DMD的治療方法。他們探索了多種可能性，比如將產生肌肉的干細胞導入患者體內，用短版本的基因來取代有缺陷的dystrophin，使用藥物促使DNA讀碼機制跳過有缺陷的外顯子，或探索各種基因編輯方法來糾正特定突變。盡管每一種方法都表現出一些希望，但許多結果都令患者和研究人員失望。

　　當CRISPR登場時，它為人們帶來新的希望，因為可以將向導RNA和Cas9的基因包裝在病毒載體中，而不需要包裝龐大的dystrophin基因。2014年，德克薩斯大學西南醫學中心的Eric Olson團隊使用CRISPR來糾正DMD小鼠模型中的dystrophin突變。在親本的生殖細胞被處理之后，研究人員記錄了小鼠幼崽中攜帶修飾基因的細胞百分比。

　　生殖系編輯對人類而言是不可行的，但小鼠展現出的良好效果鼓勵研究人員繼續追求這方面的研究，改變策略以適應不再分裂的成熟肌細胞。Olson團隊再接再厲，兩年后利用腺相關病毒（AAV）載體將CRISPR元件導入DMD小鼠模型，刪除錯誤的外顯子，并去除一個移碼突變。他們在幼鼠出生后的不同時間導入載體，發現每種方法都能夠恢復dystrophin蛋白表達，增強心臟和骨骼肌的功能。

　　在同一期的《Science》雜志上，來自杜克大學的Charles Gersbach團隊和哈佛大學的Amy Wagers團隊也利用CRISPR來刪除相同的dystrophin外顯子，并報告了肌肉功能改善。值得一提的是，Wagers的團隊還發現這種方法能夠糾正肌肉干細胞中的dystrophin，這意味著治療效果有可能長期持續。

　　“這些文章基本上都采用相同的策略，來針對單個相同的突變，”Chamberlain說。“我們想看看是否可針對其他類型的突變，特別是那些并非最簡單的情況。”

　　擴大CRISPR的潛力

　　Chamberlain的團隊決定試試CRISPR的潛力，用它來治療另一種不同的小鼠模型。在這種情況下，糾正突變需要刪除大段的基因組區域，或直接修復特定突變。

　　Chamberlain解釋道：“目前在肌肉中實現基因編輯的唯一方法是利用AAV載體將CRISPR/Cas9導入肌肉。然而，這些載體進入全身的細胞和組織，特別是肝臟。因此，這種方法將大量的Cas9核酸酶導入肌肉和非肌肉細胞，在許多非肌肉細胞中帶來長期的靶向和脫靶基因編輯。”

　　于是，Chamberlain的團隊采用了一種肌肉特異的表達框，在不分裂的肌細胞中實現Cas9的表達，并設計了兩種基因編輯策略。第一種方法是去除第52和53號外顯子，它們編碼了dystrophin蛋白的非必需部分；第二種方法直接糾正第53號外顯子的提前終止密碼子，以恢復全長蛋白的合成。

　　這個團隊最近在《Nature Communications》上報道了他們的成果，這些方法可以誘導肌肉特異的功能性dystrophin表達，從而改善小鼠模型的骨骼和心臟功能。“我們的方法表明，基因編輯可應用于導致DMD的大多數突變，盡管也許不是全部，”Chamberlain說。

　　雖然距離DMD的有效療法越來越近，但在大型動物和人類身上試驗CRISPR基因編輯之前，研究人員還有幾項重要的任務。Chamberlain表示：“效率仍然需要改進，才能實現治療水平的基因校正。此外，這種方法還要適應更多的突變類型。為了安全起見，脫靶編輯應盡量降低。最后，在第一波編輯發生后，應找到方法來降低Cas9核酸酶的活性。”

　　Chamberlain和他的團隊正在挑戰這些任務，以及探索dystrophin的不同突變，從而為基因編輯和替代系統提供更多的靶點。