(一)PCR技術直接診斷遺傳病
對于由基因缺失突變引起的遺傳病可利用缺失區域還側的DNA序列引物直接擴增 該區域,看有無特異性的擴增產物,這對缺失部位固定的片段檢測非常準確簡便,只 需一對引物即可完成,而對于哪些缺失部位異質的基因則可利用多對引物進行多重 PCR,然后檢查缺失帶.對基因的重排來說,可通過用RT-PCR檢測mRNA的融合情況來檢 出,括入亦可用PCR方法來檢出,當點突變影響到限制內性切酶切點時,可用PCR-RFL P進行分析,即將擴增產物用適當的內切酶切割,然后據電泳圖譜復制判斷有無內切 酶切點的改變,它比傳統的RFLP檢測法快速簡便,且不受同位素的危害.若突變優點 及性質已知.可用PCR-ASO,3'特異PCR及引物鐿爭法進行確定,而對于突變優點不清 楚或突變優點多變的基因則可用PCR-SSCP,DGGE,CDGE,TGGE,PCR-RNSE切割,化簡 錯配切割,異源雙鏈分析長久法進行篩選與遺傳病有關的點突變,再用PCR循環直接 測序確定突變部位和性質.
(二)利用連鎖分析間接診斷遺傳病
在有的遺傳病其基因結構龐大,基因的分子病理改變復雜或不清楚,或異質性較 高,利用PCR技術直接檢測與遺傳病有關的基因點突變有一定的困難.常常利用一些基 因內或其旁側的一些多態性標記進行連鎖分析,以間接判斷遺傳病,常以PCR方法進 行檢測的多態性標記有以下兩種.
1.PCR-RFLP
在人類基因組中存在著許多限制性內切酶切點,這些切點在人群中具有明顯的遺 傳變態性.因此可用已知DNA序列的基因內或其旁側序列中的酶切位點多態性以PCR方 法來檢測.PCR擴增后用相應的內切酶進行切割相應的擴增產物,通過用瓊脂糖蔌聚丙 烯胺凝膠電泳技術進行電泳,分析酶切位點多態性,在家庭或黃間進行連鎖分析.需 要注意的是,在用PCR-RFLP進行連鎖分析時應選擇那些雜合頻率多,即具有較高多態 信息量的酶切位點多態性.亦可采用多個多生酶切位點聯合應用.
2.Amp-FLP
在人類基因組中,除RFLP可作為遺傳標記外還有一有用的多態性標記,即VNTR(數 目可變的串聯重復序列,和STR(短的串聯重復序列).VNTR的特征是其重復的核心區內 的串聯重復單位為6-40nt,重復次斷在不同個體有所不同重復次數變化亦較大,一般 在幾次到上每次之間.STR的核心重復單痊為2-5時,其中由雙核苷酸重復(CA)n或(GT) n(n從10-60次)構成的串聯重復稱為VNDR.有意義的是,這些串聯重復序列在人群中具 有高度的遺傳多態性,人群中的雜合子比例在50%以上,最高的可達90%以上,因此它 仍可提供更多的多態信息量.VNTR和STR可用其兩端的序列合成引物,用PCR進行擴 增,PAGE+銀染堅爾比即Amp-FLP,加之這些片段呈孟德爾或遺傳,因此用之作為連 鎖分析的標記具有重要價值.目前Amp-FLP已廣泛應用多種遺傳病的連鎖分析如DMD/B MD,DKU等.最近幾年的研究還發現,已可是核苷酸重復的長度變異可導致許多人類疾 病.目前已證實的的與人類疾病有關的致病性重復之聯核苷酸有脆性×染色體綜合征 (CGG)>52,肌強直性營養不良DM(CTG)>50;×連鎖脊髓和延髓肌萎縮(CAG)HD(CAG)當. 利用串聯重復區所測序列合成的引物即可對這些遺傳病時行基因診斷.