利用SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機檢測功能對于細胞活力和細胞毒性的評價
優勢
1.儀器具有超高靈敏度化學發光檢測功能，最低至10個細胞/每孔
2.微孔板讀板高度自動優化設置，可提高檢測信號強度 軟件預置
3.軟件預置模板可以更快分析出檢測結果
簡介
SpectraMax i3x是Molecular Devices公司最新推出的一款多功能微孔板讀板機，可利用儀器所具有的化學發光檢測功能，進行細胞活力和細胞毒性相應檢測。儀器可靈敏、快速檢測出培養基中活細胞的數目和經相應處理后細胞毒性情況。Promega公司推出的CellTiter-Glo試劑是利用了螢火蟲熒光素酶反應體系中需要ATP參與才能使其發光的特點，化學發光信號強弱取決于培養基中ATP含量的高低，也就是依賴于其中活細胞數目的多少。來自于BioVision公司基于生物化學發光原理的細胞毒性檢測試劑盒，目的是檢測腺苷酸激酶(AK)的含量，AK為一種存在于所有細胞中的常見蛋白，當破壞了細胞膜完整性后其會釋放至培養基中，AK可轉化ADP至ATP，所以可以利用類似方式進行化學發光檢測。
材料
. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega P/N G7570)
. Bioluminescence Cytotoxicity Assay Kit (BioVision P/N K312-500)
. HeLa .細胞(ATCC P/N CCL-2)
. 黑色底透 96孔細胞培養板(Corning P/N 3904)
. 白色96孔細胞培養板(Corning P/N 3917)
. SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機
方法
準備試劑
使用前預先將CellTiter-Glo緩沖液和底物解凍并且平衡其至室溫，將CellTiter-Glo緩沖液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照試劑盒說明書提示，將試劑輕輕反復顛倒進行混勻。對于生物化學發光細胞毒性檢測試劑盒，其中包含了1瓶AK檢測試劑，此試劑使用前預先將1.1ml AK試劑緩沖液加入其中并輕輕混勻，需在室溫環境下平衡15分鐘后使用。這個10X的AK試劑的儲存液需要稀釋后才能成為試劑緩沖液。
細胞數目與化學發光信號關系
Hela 細胞培養在含有10%胎牛血清和雙抗的MEM培養基中，細胞經胰酶消化后，使其懸浮于培養基中進行計數。處理后的細胞鋪在96孔板中，經細胞培養基稀釋后其密度從50,000細胞每孔/100ul至10個細胞每孔/100ul。如果將細胞鋪在384孔板時，稀釋后密度從12,500細胞每孔/25ul至6個細胞每孔/25ul。對照孔中僅需加入細胞培養基用于檢測其背景的化學發光信號值。
細胞試驗過程中，精確的細胞數目可用于生成標準曲線，將不同體積的CellTiter-Glo試劑加入相應的孔板中，如100ul(96孔板)或25ul(384孔板)。將微孔板放置于振蕩器上輕混2分后，室溫條件下孵育10分鐘，等化學發光信號值穩定后再進行檢測。
ATP標準曲線
ATP以1:10稀釋度進行稀釋后加入96孔板和384孔板中，濃度從10uM至1nM，不加細胞的孔作為空白孔。CellTiter-Glo試劑可用于檢測ATP，檢測前可利用SpectrMax i3x具有的微孔板優化設置和讀取高度優化設置功能，幫助你獲得更佳信號值。
細胞活力和細胞毒性試驗
將Hela細胞預鋪在白色底透的細胞培養型96孔板中，密度為15,000/孔，培養過夜。第二天在細胞孔中加入十字孢堿(staurosporine)和茴香霉素(anisomycin)這兩種化合物來誘導細胞凋亡。這兩種化合物起始濃度都為50uM，并以1:2方式稀釋至24nM。再經過24小時孵育以后，分別使用CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑盒和BioVision的細胞毒性檢測試劑盒對處理后的細胞進行檢測。
對于CellTiter-Glo細胞活力檢測試驗，將100ul的CellTiter-Glo試劑加入含有細胞的白色微孔板中，等10分鐘左右，當細胞徹底裂解以后再進行相應檢測。
對于BioVision細胞毒性檢測試驗，每孔中取100ul處理后的細胞培養基，將其轉移至白色微孔板中，并在白色微孔板中加入100ul的AK工作液，此方法需要在30分鐘內完成檢測。
儀器設置和結果分析
SpectraMax i3x讀板機參數設置如表一所示。使用專業級別的SoftMax. pro軟件后，可直接獲得平均相對化學發光信號值(RLU)和標準偏差值。直接繪制出細胞稀釋度曲線和ATP標準曲線，選擇其中的4參數擬合方式進行擬合后快速計算出其IC50值。軟件預置模板庫中還有針對CellTiter-Glo檢測試驗的模板可方便直接調用。
結果
SpectraMax i3x讀板機針對96孔板和384孔板進行檢測時，最低檢測下限可至10細胞每孔。此種檢測方法的靈敏度遠遠高于標準比色法和絕大多數熒光法。CellTiter-Glo試劑檢測線性范圍覆蓋所有細胞濃度區間，動態學檢測范圍大于3個數量級且r2 > 0.99（圖一）。
