LC-UV法維生素B6、煙酸和咖啡因同時檢測
本方法采用常規液相色譜配合可變波長紫外檢測器，可以實現在不加離子對試劑的前提下實現維生素B6、煙酸和咖啡因的同時分離。樣品僅需簡單過濾后，即可直接檢測。分析時間短，26min 即可完成三種化合物的檢測。
維生素B6、煙酸等B 族維生素是人體不可缺少的重要營養素，對于多種疾病的預防治療有重要輔助作用。目前維生素B6、煙酸和咖啡因已被作為功效成分添加于功能飲料中。目前國家標準規定的方法(GB/T 5009.197-2003)使用高效液相色譜法測定維生素B6、煙酸和咖啡因需以硫酸月桂酸鈉、1- 癸烷磺酸鈉等離子對試劑為流動相。本方法采用常規液相色譜配合可變波長紫外檢測器，可以實現在不加離子對試劑的前提下實現維生素B6、煙
酸和咖啡因的同時分離。飲料樣品只需簡單過濾，即可進樣。
實驗條件
儀器配置
Thermo Ultimate 3000 系統：泵：DGP-3600;自動進樣器：WPS-3000SL;柱溫箱：TCC-3000;
檢測器：DAD-3000;色譜軟件：Chromeleon 7.1;
測定條件
分析柱：Acclaim PA II, C18, 4.6×150mm, 5μm;PN: 063197, SN：001323;流動相：A：0.025%TFA 的水;B：乙腈;梯度見表1;進樣量：10μL;柱溫：30℃;檢測波長：見表2。
表1. 梯度淋洗條件
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時間(min) |
流速(ml/min) |
A (%) |
B (%) |
|
0 |
1 |
0 |
100 |
|
5 |
1 |
0 |
100 |
|
8 |
1 |
12 |
88 |
|
14 |
1 |
22.2 |
77.8 |
|
15 |
1 |
100 |
0 |
|
19 |
1 |
100 |
0 |
|
19.05 |
1 |
0 |
100 |
|
26 |
1 |
0 |
100 |
表2. 波長變化條件
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時間(min) |
波長(nm) |
|
0 |
262 |
|
4.5 |
291 |
|
10 |
275 |
|
15 |
262 |
|
26 |
262 |
樣品處理
將特飲樣品經過兩層0.45μm 的濾膜過濾后裝瓶，待測。
實驗分析
標準品色譜圖見圖1、2、3。
圖1. 五針VB6 疊加譜圖(500μg/L，291nm)。
圖2. 五針煙酸疊加譜圖(2mg/L，262nm)。
圖3. 五針咖啡因疊加譜圖(5mg/L，275nm)。
線性、檢出限
以標樣色譜峰面積對濃度做工作曲線，具有良好線性，線性相關系數r 大于0.999。線性數據見表3 所示。分別對500μg/L 的VB6、2mg/L 的煙酸和5mg/L 的咖啡因標準溶液做重現性考察，RSD 分別為<2.1%，具體見表3。
表3. VB6、煙酸和咖啡因線性范圍及重現性
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分析物 |
波長(nm) |
線性范圍(mg/L) |
標準曲線 |
r2 |
濃度（mg/L） |
RSD (%, n=5) |
|
VB6 |
291 |
0.1~10 |
Y=0.477X |
0.9999 |
0.5 |
2.09 |
|
煙酸 |
262 |
1~100 |
Y=0.408X |
1.0000 |
2 |
1.42 |
|
咖啡因 |
275 |
5~200 |
Y=0.478X |
0.9999 |
5 |
1.80 |
實際樣品分析
按照樣品前處理方法測定三種批次的相同品牌功能飲料樣品，測定結果如圖4。
圖4. 樣品譜圖
表4. 樣品中各組分含量結果
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VB6（ppm） |
煙酸（ppm） |
咖啡因（ppm） |
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|
第一瓶第一次進樣 |
3.1959 |
35.8177 |
200.0183 |
|
第一瓶第二次進樣 |
3.1587 |
35.3990 |
197.6941 |
|
第一瓶第三次進樣 |
3.1935 |
35.7504 |
199.6872 |
|
第一瓶第四次進樣 |
3.1824 |
35.6723 |
198.0955 |
|
第一瓶第五次進樣 |
3.2426 |
36.3285 |
202.2690 |
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第二瓶 |
3.1265 |
35.0045 |
194.5447 |
|
第三瓶 |
3.1221 |
34.9055 |
194.1764 |
|
平均值 |
3.174528571 |
35.55399 |
198.0693 |
|
STD |
1.338% |
1.3915% |
1.4831% |
結果討論
本方法根據功能飲料樣品的標識含量，選取相關濃度的標準品對VB6、煙酸和咖啡因做標準曲線，線性范圍在40倍以上，線性良好，根據標準曲線得出的數據接近飲料中標明的濃度(咖啡因200ppm，煙酸40ppm，VB64ppm)，通過放大譜圖可以看到，目標化合物附近幾乎沒有任何干擾，結果證明該方法適合飲料類樣品中相關化合物的檢測。如果采用DAD
檢測器進行不同時間進行不同波長的設定，可以更有效的降低干擾。本實驗通過對相同低濃度的標準品反復進樣得到該方法的精密度數據，RSD<2.1%，又分別對同一瓶飲料里的不同樣品和不同瓶飲料里的樣品進行重復性實驗，RSD<1.5%，大量數據顯示Thermofisher
U3000 系列液相色譜儀適合對該類型飲料進行檢測。該方法樣品僅需簡單過濾后，即可直接檢測。分析時間短，26min 即可完成三種化合物的檢測。
小結
本方法采用常規液相色譜配合可變波長紫外檢測器，可以實現在不加離子對試劑的前提下實現維生素B6、煙酸和咖啡因的同時分離。飲料樣品只需簡單過濾，即可進樣。該方法樣品僅需簡單過濾后，即可直接檢測。分析時間短，26min 即可完成三種化合物的檢測。對同一瓶飲料里的不同樣品和不同瓶飲料里的樣品進行重復性實驗，RSD<1.5%。本文大量數據顯示Thermofisher U3000 系列液相色譜儀適合對該類型飲料進行檢測。