DNA (500 ng) is digested with Nsp I and Sty I restriction enzymes and
ligated to adaptors that recognize the cohesive 4 bp overhangs. All
fragments resulting from restriction enzyme digestion, regardless of
size, are substrates for adaptor ligation. A generic primer that
recognizes the adaptor sequence is used to amplify adaptor-ligated DNA
fragments. PCR conditions have been optimized to preferentially amplify
fragments in the 200 to 1,100 bp size range. PCR amplification products
for each restriction enzyme digest are combined and purified using
polystyrene beads. The amplified DNA is then fragmented, labeled and
hybridized to the array.
3、微點樣法制備SNP檢測DNA微陣列芯片
微點樣法是制備DNA微陣列芯片的主要方法之一。該方法將事先設計并合成好的DNA探針通過點樣儀（arrayer）按照一定的排列方式微量針點或噴點固定到固體基底表面，制備成DNA微陣列芯片（圖27-4）。在芯片的制備過程中，基底材料的選擇及其表面的化學修飾是至關重要的。許多材料都可以用作生物芯片的基底材料，如濾膜、玻璃片以及水凝膠膜。
3.1、載玻片及其氨基硅烷化修飾
由于玻片容易獲得，具有本地熒光低、透明度高、熱學性質好、硬度高、易于在表面進行化學修飾以固定核酸探針等特點，從而使之成為一種目前最為常用的生物芯片基底材料之一。此外載玻片表面光滑，而且沒有多孔結構，標記的靶序列可以直接與固定探針結合，而不會受擴散效應的影響，具有較高的局部濃度和較快的雜交反應速度。這種沒有多孔結構的表面也非常適合洗脫多于探針和非特異性吸附的標記靶標序列。大多數商品化的用于制備生物芯片的載玻片已經經過多聚賴氨酸、氨基硅烷或氨基修飾（圖27-5）。盡管光滑無孔的載玻片在生物芯片應用中具有很多優點，但是這種載玻片在固定結構化生物分子，如抗體分子或結構化的寡核苷酸探針分子時很難保持其固有的分子結構；而且這種載玻片表面的固定能力有限，影響了檢測靈敏度。
載玻片的氨基硅烷化及DNA固定原理如圖27-5所示。氨基修飾氨基硅烷化基底需要使可逆的希夫堿（Schiff's base）還原成穩定的烷胺鍵化合物，圖27-6為硼氫化鈉還原步驟示意圖。
3.2、載玻片上涂覆的水凝膠或聚合物膜：
為了解決平滑無孔載玻片的缺陷，將一種功能化的三維親水多孔凝膠（如聚丙烯酰氨凝膠塊）鋪在載玻片表面，作為固定DNA分子的基底材料（圖27-7）。多孔水凝膠材料結合
了平滑載玻片反應速度快和孔狀材料可提供類似于液相的環境及較大的固定能力等優點。在這種基底上進行的雜交反應更接近于均一液相環境中的反應而不是固液界面的反應。而且這類多孔凝膠膜可在通用商品化的精密度較高的芯片點樣儀和掃描儀上使用。這類水凝膠膜的缺陷是具有較高的熒光背景，反應完后需要經過長時間的清洗，才能除去表面非特異吸附的標記靶標；其次，在于液體接觸時遇到較高雜交溫度很容易破碎甚至溶解；最后，它的制備過程比較復雜，商品化的基片價格昂貴。
瓊脂糖中鄰近的羥基可在較為溫和的條件下被高碘酸鈉氧化，生成醛基。醛基可以與修飾了氨基的DNA分子探針反應形成希夫堿（圖27-7）。
醛基可以與修飾了氨基的DNA分子探針反應形成希夫堿（Schiff's base）。