包涵體蛋白溶解后的重折疊實驗（四）

三、蛋白質重折疊條件的篩選實驗

1. 系統的重折疊篩選

在 前 面 所 述 的 常 規 流 程 以 及 討 論 中 , 我 們 假 設 已 經 知 道 了 針 對 目 標 蛋 白 質 的 合 適 重折 疊 溶 液 。然 而 ，這 是 設 計 有 效 的 重 折 疊 方 案 時 最 不 可 缺 少 也 是 最 困 難 的 部 分 。在 早 期敘 述 的 蛋 白 質 重 折 疊 論 文 中 ，通 常 只 選 用 一 種 重 折 疊 溶 液 ，它 或 者 有 效 或 者 無 效 。那些 有效 的 就 發 表 出 來 ，而 無 效 的 則 通 常 舍 棄 。這 導 致 的 結 果 就 是 早 期 成 功 進 行 重 折 疊 的 蛋 白
質 是 那 些 通 常 在 許 多 不 同 的 條 件 下 都 能 很 容 易 地 重 折 疊 的 蛋 白 質 。近 年 來 ，人 們 越 來 越明 白 許 多 蛋 白 質 只 能 在 非 常 特 殊 的 條 件 下 才 能 重 折 疊 。挑 戰 已 經 變 為 如 何 對 許 多 可 能 的條 件 進 行 篩 選 以 從 中 挑 選 出 能 有 效 地 促 進 蛋 白 質 重 折 疊 的 條 件 。最 重 要 的 一 個 進 展 是 使用 部 分 因 子 原 理 (fractional factorial approach)去 系 統 地 確 定 許 多 不 同 變 量 的 影 響 (A r m -
strong et a L , 1999; C o wieson et al.， 2006; Quronfleh et al., 2007; TTre saugues et al.，2004; Vincentelli et al.，2004;Willis et al., 2005)。

已 經 開 發 了 數 種 商 業 化 的 產 品 用 于 幫 助 研 究 者 鑒 定 合 適 的 蛋 白 質 重 折 疊 條 件 。關于蛋 白 質 重 折 疊 條 件 篩 選 和 相 關 操 作 方 案 的 更 多 信 息 可 參 考 下 面 的 公 司 網 站 。

A t h e n a E S QuickFold? (15-solution kit), http：//w w w .athenaes.c o m /QuickFoldProteinRefolding Kit；

EMD/Novagen， s iF0LDl? 、 iF0LD2? 和 iFOLD3?(96-solution kit), http:,//www. novagen. com;

Pierce Biotechnology’s ProMatrix? ( 9 6 -solution kit c o m p o n e n t s ) ， http://w w w .fishersci.c o m 。

隨 著 這 種 篩 選 技 術 使 用 經 驗 的 積 累 和 新 的 輔 助 方 法 的 鑒 定 , 這 個 名 單 很 可 能 會 變 長 ，篩 選 技 術 也 會 繼 續 進 步 。必 須 注 意 的 是 , 對 于 那 些 買 不 起 這 些 昂 貴 試 劑 盒 的 研 究 者 來 說 ，沒 有 什 么 可 以 阻 止 他 們 設 計 一 套 自 己 的 測 試 溶 液 及 制 訂 自 己 的 蛋 白 質 重 折 疊 篩 選 方 法 以滿 足 他 們 特 殊 的 需 求 ，這 里 的 關 鍵 是 系 統 的 平 行 篩 選 多 種 重 折 疊 條 件 。

2.重折疊中的變量

存 在 許 多 的 溶 液 變 量 (如 P H 、溫 度 、鹽 濃 度 、氧 化 還 原 環 境 和 二 價 離 子 的 存 在 )和添加 劑 (additive) (已 有 報 道 顯 示 它 們 能 夠 提 髙 溶 解 的 包 涵 體 蛋 白 的 重 折 疊 效 率 )。在 設 計前 面 提 到 的 商 業 化 蛋 白 質 重 折 疊 篩 選 產 品 時 已 經 考 慮 到 了 這 些 變 量 和 添 加 劑 ，它 們 也 為那 些 想 要 設 計 自 己 的 蛋 白 質 重 折 疊 篩 選 方 法 的 研 究 者 提 供 了 示 例 。下 面 討 論 了 這 些 變量 。其 他 的 關 于 蛋 白 重 折 疊 的 綜 述 對 其 中 一 些 變 量 有 更 詳 細 的 討 論 (A r m s t r o n g et a L ，1999； C o w i e s o n et al.> 2006； Middelberg； 2002； Quronfleh et al.> 2007； Schein> 1991；Singh and P a n d a , 2005; Tresaugues et al., 2004； Vallejo and Rin a s, 2004； Vincentelli
et a l , 2004； Willis et al., 2005)

(1) p H 大 部 分 蛋 白 質 重 折 疊 在 p H 5 ? 9 內 完 成 ，在 我 們 實 驗 中 ，大 部 分 蛋 白 質 在p H 8? 8. 5 時 重 折 疊 效 果 最 好 。 一 般 來 說 ，所 使 用 的 p H 距 蛋 白 質 等 電 點（蛋 白 質 不 帶 凈電 荷 ，最 傾 向 于 沉 淀 時 的 p H )至 少 相 差 一 個 單 位 是 個 不 錯 的 想 法 。

(2) 溫 度 目前，沒有明顯的趨勢表明有任何廣泛適用的最佳蛋白質重折疊溫度。大部分研究者在接近 室 溫 的條件下進行蛋白質重折疊。這個溫度對于 防 止 蛋白質的熱損傷足夠低，對于增加分子的熱力學運動又足夠高, 分子的熱運動對于溶解瞬時錯誤折疊構象和達到天然構象可能是非常重要的。有人也許會說更髙的溫度會加強可能導致聚集的疏水相互作用，但它也會加強將疏水殘基埋在天然構象內部時所需的疏水相互作用。

Xie和 Wetlaufer(1996)發表了一篇非常有趣的文章, 該文涉及在4 m g / m L 的蛋白質濃度下， I m o l / L G u H C l 和 50 m m o l / L Tris 硫酸 (Tris sulfate)，p H 7. 5 的條件下，在不同溫度下重折 疊 碳 酸酐 酶 IKcarbonic anhydrase II) 。其 結 果表明在低溫(4? 12°C)下重 折 疊 120 min, 然后溫度「跳躍」（temperature*leap)至 36°C并 持 續 30 min，這樣可以得到非常好的酶活回收率(>9 〇 %)。他們認為在低溫下疏水相互作用會被減小，從而盡可能的降低了聚集作用，同時允許蛋白質緩慢的轉變為一種無活性的或無聚集傾向的中間體 。當溫度從 4°C「跳躍」至 36°C 時，這種中間體就會轉化為有高活性的天然形式。

(3) 鹽 濃 度 可 能 需 要 某 些 鹽 來 起 到 「鹽 溶 』』 (salting in) 作 用 以 增 加 天 然 蛋 白 質 的 可溶 性 (見 本 書 第 20 章）。 通 常 使 用 50? 100 m m ol/L 的 鹽 。在 對 6 m ol/L 鹽 酸 狐 稀 釋 60倍 時 ，鹽 酸 胍 的 終 濃 度 就 變 為 〇. I m ol/L。 為 了 不 影 響 與 合 適 的 離 子 交 換 層 析 柱 的 結 合 ，通 常 避 免 加 入 其 他 鹽 以 使 鹽 濃 度 就 保 持 在 足 夠 低 的 水 平 。

(4) 氧 化 還 原 試 劑 前面關于再氧化的章節已經討論了使用氧化還原緩沖液輔助二硫鍵的形成。在一些商業化試劑盒中，包含有無還原劑溶液、有還原劑溶液，以及含有不同比例的還原劑和氧化劑的氧化還原緩沖液。

(5) 二價陽離子 該 變 量 還 未 經 過 全 面 的 探 索 研 究 ，但已知天然蛋白質通常含有二價陽離子(如 M g 2+ 或 Z n 2+ ) 作為其結構的一部分。顯 然 ，任何能夠穩定蛋白質天然結構的因素都會利于重折疊向天然構象的方向進行，而遠離蛋白質的聚集。

(6) 精 氨 酸 和 其 他 氨 基 酸 有 大 量 的 文 獻 描 述 了 使 用 精 氨 酸 (arginine) 來 促 進 溶 解蛋 白 的 重 折 疊 ，以 及 解 釋 其 如 何 減 弱 了 聚 集 作 用（A r a k a w a et al.，2007; Baynes et al.，2005; D a s et al.，2007; D o n g et al.，2004; R e d d y et al.，20 〇 5) 。似 乎 精 氨 酸 可 以 通 過 降低 蛋 白 質 間 相 互 作 用 的 速 率 來 減 弱 聚 集 作 用 。 D a s 等 認 為 這 是 由 于 精 氨 酸 在 溶 液 中 形 成了 超 分 子 組 裝 體 (supramolecular assembly) 。其 缺 點 之 一 是 通 常 在 0. 5 ? 1. 0 m o l /L 濃度 下 使 用 ，這 也 是 其 最 有 效 的 范 圍 。如 果 不 經 稀 釋 或 透 析 ，此 濃 度 就 會 妨 礙 后 續 的 Ni2+ 螯合 親 和 層 析 柱 色 譜 ，并 會 阻 止 大 部 分 蛋 白 質 與 離 子 交 換 層 析 柱 的 結 合 。已 經 發 現 天 然 的 滲
透 保 護 劑 (osmoprotectant) 脯氨酸有時無論在體夕卜還是體內也能增強蛋白質可溶性。

(7) 甘 油和糖 [ 蔗 糖 、甘露糖醇(mannitol)、山梨糖醇(sorbitol) 和 海 藻 糖 (trehalose)]我 們 已 經 發 現 在 許 多 時 候 甘 油 都 是 非 常 好 的 蛋 白 質 重 折 疊 添 加 劑 ，通 常 的 使 用 濃 度 為5 % ? 3 0 % 。 S h i m a m o t o 等 (1998) 使 用 的 一 個 極 端 的 方 法 涉 及 將 包 涵 體 用 6 m o l /L 鹽 酸胍 溶 解 至 2?10 m g /m L ，加 入 甘 油 至 5 0 % (V /V ) ，在 7 5 % 甘 油 中 透 析 以 除 去 變 性 劑 , 然后 快 速 稀 釋 至 5 % ? 1 0 % 的 低 甘 油 濃 度 。 已 經 發 現 一 些 糖 為 〇. 5 ? I.5 m o l /L 時 能 成 功地 促 進 蛋 白 質 重 折 疊 ( B o w d e n and Georgiou, 1988)。

(8) 其 他 化 學 添 加 劑 大量的各種各樣的論文報道使用諸如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG ) (Cleland et al.， 1992)、環糊精（cyclodextrin) (Rozema and Gellm an， 1996)，以及各種非去污劑橫酸甜菜喊（nondetergent sulfobetaine，NDSB) (Expert-Bezancon etal.， 2 0 0 3 ) 這樣的物質來促進特定蛋白質的重折疊。有報道稱特定的離子液體(i 〇 nic liquid) (如熔點低于 100°C 有機鹽）， 例 如 ，A T -烷 基 N - 甲 基咪唑氯化物 (N’-alkyl-N -m ethylimidazolium chloride)可作為重折疊添加劑（Lange et al.， 2005)。乙基（e th y l)和丙基衍生物 (propyl derivative)在 0?5 ? I. 0 m ol/L 的 濃 度 下 表 現 出 了 與 左 旋 精 氨 酸 (L-arginine) 相當的增加蛋白質活性和重折疊產量的作用。

(9) 去 污 劑 理論上, 去污劑在重折疊時應該可以幫助阻止聚集作用。在低濃度下，它們與暴露的疏水區或黏性區微弱結合，并將其掩蓋，從而阻止聚集作用。當它們的濃度降低時，就會從蛋白質解離從而允許蛋白質天然構象的形成。這被認為是十二烷基肌氨酸鈉能夠很好地起作用的原因。在高濃度下，其為變性劑，在低濃度下其就作為人工分子伴 侶 ，阻止了聚集作用從而促進重折疊。

(10) 離液劑（chaotropic a g e n t)( 高濃度下 的 變 性 劑）由 于 聚 集 作 用 是 由 部 分 折 疊的 中 間 體 之 間 的 相 互 作 用 導 致 的 , 有 時 在 重 折 疊 溶 液 中 加 人 非 變 性 劑 量 的 離 液 劑（chaotrope) 對 解 離 聚 集 體 是 有 用 的 ，同 時 不 會 損 傷 更 穩 定 的 天 然 結 構 。常 用 I m 〇 l/L 尿 素 和
0.5 m o l /L 鹽 酸 胍 。

(11) 目 標 蛋 白 質 特 異 的 添 加 劑 如 同 前 面 關 于 特 定 二 價 陽 離 子 的 潛 在 好 處 的 論 據一 樣 ，諸 如 合 適 的 底 物 、輔 因 子 (cofactor) 、或 必 需 的 血 紅 素 基 團 ( h e m e gro u p) 等 物 質 的 存在 可 以 穩 定 目 標 蛋 白 質 天 然 結 構 , 提 高 其 重 折 疊 產 量 。