HRP 標記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼) , 是一類重要的發光試劑。其結構如圖4 所示。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行,在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2 -) , 單線態氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH·) , 過氧化氫(H2O 2)]存在下,生成激發態中間體, 當其回到基態時發光, 其波長為425nm。
早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體) ,但標記后發光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體, 進行免疫反應后利用魯米諾作為發光底物, 在過氧化物酶和起動發光試劑(NaOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發光, 發光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM半自動分析系統就是利用這一體系專門設計的。