化學發光免疫分析的發展

化學發光免疫分析的發展

化學發光免疫分析（CLIA）以分析靈敏度高、線性范圍寬、無散射光、試劑消耗低等優點被廣泛應用于生命科學、臨床診斷、環境監測、食品安全和藥物分析等領域。當前各種新標記物、標記方法、多項技術聯用及各種自動化、微型化的儀器不斷被開發出來，化學發光免疫分析（CLIA）也達到了更高的水平，朝著高靈敏度、多組分聯合檢測和自動化檢測方向發展。

1. CLIA技術優勢

除CLIA外，利用免疫技術的分析方法還有酶聯免疫吸附（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、熒光免疫分析（FIA）等技術方法。CLIA與ELISA的原理和操作步驟相似，因此CLIA有時也被稱為CL-ELISA，區別為ELISA的結果通過顯色反應呈現，CLIA的結果由發光反應呈現，在同樣實驗條件下檢測相同待測物時，CLIA的靈敏度高于ELISA。與RIA相比，CLIA的誤診率更低，靈敏度與特異度更高，無放射危害，標記物不受半衰期影響，試劑盒保質期長。隨著技術改進，FIA的背景干擾在逐漸降低，但由于需要外源紫外光的激發，FIA的背景干擾仍大于CLIA。此外，與高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）等相比，CLIA還具備線性范圍寬、操作簡便、檢測時間短等優勢。

表1. 四種常用免疫分析技術對比

1.1 寬動態范圍

CLIA方法的寬動態范圍意味著更高的分析靈敏度和準確檢測高濃度抗體的能力，而無需稀釋樣品。CLIA測定與ELISA和FEIA測定在測量某些抗體的動態間隔幅度（2-3個數量級）存在差異，這對患者的臨床管理具有重要意義，且檢測陽性率優于FEIA。

1.2 分析靈敏度和預測價值

采用CLIA技術進行自身抗體檢測可顯著提高免疫學實驗效率，以應對科學界提出的不斷擴大的自身抗體種類及由于自身免疫疾病意識增強而從各個臨床學科增加的測試需求。引入自動化分析儀，可在短短幾個小時內完成抗體測試，從而進行臨床診斷。

1.3 周轉時間和響應的有效性

CLIA允許同時檢測各種單一自身抗體，在一小時內獲得定量結果。一些危及自身免疫疾病的出現，可能導致重要器官功能的快速進行性喪失，因此快速獲得抗體檢測結果對于臨床實踐至關重要，以便及時診斷進行響應免疫治療。

2. 化學發光免疫分析的發展趨勢

目前CLIA多由離散測試組成，即一次測量一種抗體。然而對于多參數測試的需求不斷增多，這些測試可以在單個分析步驟中以合理的成本高效識別復雜免疫學圖像的所有組成部分。多重免疫測定可以為建立多參數CLIA測試打開大門。同時利用免疫反應的靈活性，將CLIA與多種技術聯用可提高檢測靈敏度與特異性，縮短檢測時間，提高檢測效率。

2.1 高靈敏度檢測

實際樣品的豐度低，在檢測過程中也存在著信噪比低的問題，同時如果檢測方法穩定性不好也會對結果造成影響。化學發光免疫測定中，使用新發光試劑、增強劑，構建新的發光體系以及優化反應時間、選擇合適的緩沖液等方法，可以大大提高檢測范圍和檢出限及穩定性。得益于納米技術的發展，各種納米粒子及結構也被引入化學發光體系中，如金納米粒子、銀納米粒子、鉑納米粒子等，由于它們具有高比表面積及電子密度，對于化學發光體系有很強的催化作用。

金納米粒子作為最廣泛使用的金屬納米粒子，可以作為模擬酶以及酶或大分子的載體。有實驗表明，以辣根過氧化物酶功能化的金納米顆粒作為抗體標記物，利用夾心標記法，實現對待測蛋白的信號放大檢測，比原來工作中沒有利用金納米顆粒的方法信號提高了數倍。磁性納米粒子則可以作為免疫反應的載體，通過磁場將免疫復合物與原始溶液分離，大大縮短了檢測的時間，提高了檢測的靈敏度。隨著納米技術領域的不斷發展，利用納米材料輔助的化學發光技術未來仍然具有廣闊的發展空間。

2.2 多組分檢測

相比于單個組分的分析，對多組分進行聯合分析可以獲得更多的信息，得出的結論也更加具有說服力。若對多組分中的每種組分都進行單個分析，存在著耗時長、試劑消耗多的問題。通過結合空間分辨技術與陣列檢測器的同時分析方法則可以實現對于高通量樣品的快速檢測，而且試劑消耗少。如雙通道流通池，實現了對于CA153、CA125、CA19-9和CEA四種腫瘤標志物的檢測，移動光柵就可以獲得被光電倍增管收集到的不同通道的信號。

微流控芯片是實現多組分分析的有利工具。通過材料基質上刻蝕或壓模便可形成所需要的微通道來實現所需的功能。有研究設計了一種微流控芯片用于檢測睪丸激素和C反應蛋白，芯片的頂部為試劑儲存區，中部為抗原抗體儲存區，底部為硅樹脂基板。不同的試劑預先裝載在儲存區并通過程序控制的閥門避免進入微通道，當樣品引入后預加載到微流體裝置的單個儲層中，并在關閉狀態下通過片上機械閥從微通道中隔離。將樣品引入后，閥門開啟，通過發光儀可實現自動化檢測。

毛細管電泳（CE）和高效液相色譜（HPLC）具有極強的分離能力，可應用在化學發光免疫分析方法的前處理階段。除此之外，層析技術也實現了與化學發光技術的耦合。免疫層析技術通過樣品在基質上的流動可以實現復雜組分中不同組分的分離以及反應產物與未反應產物的分離，不需要在分析過程中沉淀或是洗滌復合物，具有操作簡便、簡單經濟的特點。有研究設計了免疫層析試紙條，通過記錄在硝酸纖維素膜的兩個測試區捕獲的探針的化學信號，實現對于萊克多巴胺和沙丁胺醇的檢測。

2.3 自動化檢測

傳統免疫分析需要將免疫物質人工混合導致反應效率降低，會耗費較多的時間。流動注射分析（flow injection analysis，FIA）由于不需要人工來進行操作，能夠自動化地進行分析，可以減少誤差，縮短反應的時間，已經被利用在基于化學發光方法的免疫測定中。通過加快反應動力學如利用容易控制的電場來加快免疫物質的傳質速率或是采用電磁攪拌等常用的方法同樣可以減少分析時間， 并且由于這些方法容易構建，可以大大提升化學發光免疫分析的自動化水平。隨著技術的發展，結合各類輔助方法，具有各類不同功能的全自動免疫發光儀不斷被開發出來并應用在臨床檢測中。 然而，目前自動化的化學發光免疫分析儀仍然由國外公司占主導地位，以羅氏（Roche）、貝克曼（Beckman）等公司產品為主，國產化學發光免疫分析儀距離替代進口產品還有很大的進步空間。 隨著化學發光免疫分析法在我國臨床上的普及，市場規模仍在不斷增長，國產自動化儀器與國外產品之間的差距會逐漸縮小。